ICS 65.020.20 B 05 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3543—2019 菊花种质资源常温离体保存技术规程 Technical Regulations for In vitro Conservation under normal temperature Of Chrysanthemum morifolium Germplasm 文稿版次选择 2019 - 12 - 25 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 01 - 25 实施 发 布 DB34/T 3543—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由阜阳师范大学提出。 本标准由安徽省林业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：阜阳师范大学、阜阳市颍菊生态农业发展有限公司、亳州市沪谯药业有限公司、 太和县淼林现代农业发展有限公司、安徽农之源生态农业有限公司、安徽大汇生态科技发展有限公司、 阜阳市花卉管理办公室。 本标准起草人：兰伟、陈玉龙、马冲、高贯彪、候林威、刘晓艳、张静博、郭长达、张源、谢欣雨、 胡中盛、郑萍、尚冰冰、李振、张程飞、王其丰。 I DB34/T 3543—2019 菊花种质资源常温离体保存技术规程 1 范围 本标准规定了菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）种质资源常温离体保存的种质材料、主 要培养场所、培养基的配制、离体材料选取及消毒、常温离体保存、遗传稳定性检测。 本标准适用于菊花种质资源的常温离体保存。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 19557.19 植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南 菊花 NY/T 1491 花卉植物病毒检测规程 3 种质材料 3.1 来源 必须保证遗传纯正，来源清楚。 3.2 无病毒 按照 NY/T 1491 规定的方法进行病毒检测，确保材料不携带菊花B 病毒（CVB）、番茄不孕病毒 （TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）等。 3.3 无变异 未发生变异。 3.4 登记 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 4 4.1 名称：种质名、品系名、地方名。 引种情况：来源地、引种人、原保存单位及编号、引种时间。 种质编号：统一编号、引种号、采集号、保存号。 保存情况：保存材料、保存者、保存数量、继代时间、继代次数、操作人。 主要培养场所 准备室 用于玻璃、塑料器皿及其他实验用具的清洗、干燥和保存；药品的称量、溶解、配制，培养基的配 制、分装、包扎和灭菌；外植体材料的预处理、培养材料的观察分析等。 1 DB34/T 3543—2019 4.2 接种室 要求干爽安静，清洁明亮，墙壁光滑平整，地面平坦无缝隙。 放置超净工作台，无菌条件下进行外植体的消毒、接种和瓶苗的转接等。 4.3 培养室 用于瓶苗的无菌培养、观察和中长期离体保存。 5 培养基的配制 5.1 培养基类型的选择 选择 MS 培养基为基本培养基，参见附录A。 5.2 母液与激素的配制 5.2.1 大量元素母液的配制 按 10 倍液配制，放置于棕色瓶中，保存于 4℃冰箱中备用。 5.2.2 微量元素母液的配制 按 100 倍液配制，放置于棕色瓶中，保存于 4℃冰箱中备用。 5.2.3 有机母液的配制 按 50 倍液配制，放置于棕色瓶中，保存于 4℃冰箱中备用。 5.2.4 铁盐的配制 将硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠分别溶于蒸馏水中，加热不断搅拌，使完全溶解，冷却后，将两者 溶液充分混合，定容至所需体积。按 100 倍液配制，放置于棕色瓶中，保存于 4℃冰箱中备用。 5.2.5 6-BA 的配制 称取 50 mg 6-BA，用少量 1 mol·L 5.2.6 -1 培养基 pH 值 离体材料选取及消毒 2 -1 NaOH 溶解，再用蒸馏水定容至 100 ml，浓度为 0.1 mol·L 。 -1 腋芽诱导培养基: 1/2 MS（大量元素减半，其它成分不变）+30 g·L 蔗糖+6.5 g·L 琼脂。 -1 -1 -1 -1 增殖培养基：MS+BA 0.5 mg·L +NAA 0.1mg·L +30 g·L 蔗糖+6.5 g· L 琼脂。 培养基 pH 值为 5.8。 6 -1 培养基配方 5.3.1 5.3.2 5.4 -1 HCl 溶解，再用蒸馏水定容至 100 ml，浓度为 0.5 mol·L 。 NAA 的配制 称取 10 mg NAA，用少量 1 mol·L 5.3 -1 DB34/T 3543—2019 6.1 选取和清洗 选取符合 3.1 、3.2 和 3.3 要求，并按照 3.4 编号登记的嫩枝，去掉叶片和部分叶柄，流水冲 洗干净。 6.2 接种工具消毒 接种前，将剪刀、镊子等接种工具在高压灭菌锅中灭菌，取出后浸入 75％的乙醇中；接种时，再 进行燃烧灭菌，放凉备用。燃烧时，应注意浸入乙醇的一端倾斜向下，不可倒置。 6.3 离体材料消毒 无菌滤纸吸干嫩枝表面水分，浸入 70％乙醇中表面消毒 30 s，再浸入 0.1％升汞溶液消毒 5 min～ 10 min，无菌水冲洗 4 次～5 次。 7 7.1 常温离体保存 外植体的剪切 用剪刀剪取表面消毒的嫩枝中上部两个节茎段。 7.2 无菌再生体系建立 将剪切的外植体按生长极性方向，接种于腋芽诱导培养基上。培养 20 d 后，将其腋芽转接到增殖 培养基上。 7.3 离体保存 -1 -1 -1 -1 在增殖培养基中添加 1500 mg· L ～2000 mg· L 的矮壮素（CCC）或 6 mg.L ～9 mg.L 多效唑 （PP333）。选用培养 30 d 的瓶苗两个节茎段接种保存。 7.4 保存条件 -1 保存温度为（25±2）℃，光照强度 2000 Lx～3000 Lx，光照时间 12 h ·d 。 7.5 保存数量 每份种质保存 10 瓶以上，每瓶 3 个～4 个保存材料。 7.6 继代时间 每 10 个～12 个月继代 1 次。 7.7 恢复生长 -1 -1 -1 -1 将离体保存的瓶苗转接到 MS+BA 0.5 mg·L +NAA 0.1 mg·L +30 g·L 蔗糖+6.5 g· L 培养基上培 养。 8 遗传稳定性检测 再生植株遗传稳定性应符合 GB/T 19557.19 的规定。 3 DB34/T 3543—2019 AA 附 录 A （资料性附录） MS 培养基成分表 表A.1 MS 培养基成分表 单位：mg·L 成分 大量元素 微量元素 铁盐 有机 含量 硝酸钾 KNO3 1900 硝酸铵 NH4NO3 1650 硫酸镁 MgSO4·7H2O 370 磷酸二氢钾 KH2PO4 170 氯化钙 CaCl2·2H2O 440 硫酸锰 MnSO4·4H2O 22.3 硫酸锌 ZnSO4·7H2O 8.6 硼酸 H3BO3 6.2 碘化钾 KI 0.83 钼酸钠 Na2MoO4·2H2O 0.25 硫酸铜 CuSO4·5H2O 0.025 氯化钴 CoCl2·6H2O 0.025 乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA 37.25 硫酸亚铁 FeSO4·7H2O 27.85 甘氨酸 2.0 盐酸硫胺素 0.1 盐酸吡哆醇 0.5 烟酸 0.5 肌醇 100 _________________________________ 4 -1