ICS 65.020.20 B 16 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 2172—2020 甘蔗黑穗病的鉴定方法 PCR 法 Method of PCR method for detection of sugarcane smut 2020 - 10 - 29 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2020 - 11 - 30 实施 发 布 — DB45/T 2172 2020 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 缩略语 ............................................................................ 1 5 原理 .............................................................................. 2 6 材料和试剂 ........................................................................ 2 7 仪器和设备 ........................................................................ 3 8 引物 .............................................................................. 3 9 操作步骤 .......................................................................... 3 10 结果判定 ......................................................................... 4 附录 A（资料性） 样品检测电泳图 ...................................................... 5 I — DB45/T 2172 2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。 本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西吉锐安全技 术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心。 本文件主要起草人：梁俊、苏丽梅、刘守廷、龙智翔、黄易勤、黄小娟、刘月东、刘巧频、杨振媚、 黄芳、朱玉连、韦秀兰。 III — DB45/T 2172 2020 甘蔗黑穗病的鉴定方法 PCR 法 1 范围 本文件规定了甘蔗黑穗病的PCR检测方法。 本文件适用于甘蔗组培苗、种苗、种茎及大田植株黑穗病菌的分子检测及判定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 甘蔗黑穗病 甘蔗黑穗病是一种普遍存在于大多数植蔗国家和地区的主要甘蔗病病害，病原菌是真菌中的担子菌 门黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌，甘蔗黑穗病借气流、雨水、灌溉水、人事活动等在田间进行传播扩散，浸染 甘蔗芽与分蘖，产生一条黑色穗状物，造成甘蔗产量和含糖量大幅降低。 3.2 聚合酶链式反应（PCR） PCR反应（Polymerse Chain Reaction, 聚合酶链式反应）是在变性、退火、延伸三个温度下，利 用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增，在短时间内使目的片段的扩增量达到数千万倍， 从极微量的DNA起始，扩增出µg级的PCR产物。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）； DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）； dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）。 1 — DB45/T 2172 2020 5 原理 甘蔗黑穗病病原菌产生孢子，分布在甘蔗植株内外，通过提取甘蔗黑穗病孢子的DNA，设计特定引 物，利用PCR检测技术对甘蔗黑穗病DNA进行体外扩增检测，可得到准确的鉴定结果。 6 材料和试剂 除另有说明外，本文件中使用分析纯（含）以上试剂，用水符合GB/T 6682规定的二级水，涉及PCR 用水要求达到一级水指标。 6.1 试剂 三羟甲基氨基甲烷（C H NO ）：纯度＞99%。 乙二胺四乙酸二钠（EDTA·2Na）：纯度≥99.0%。 硼酸（H BO ）：ρ=1.43 g/cm³，含量≥99.5%。 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：ρ=1.32 g/mL，纯度≥99.0%。 氯化钠（NaCl）：ρ=2.165 g/cm³，含量≥99.5%。 琼脂糖。 Gel-Red 核酸染料。 液氮（N ）：ρ=0.81 g/cm³。 三氯甲烷（CHCl ）：ρ=1.50 g/cm³。 无水乙醇（CH CH OH）：ρ=0.79 g/cm³，含量≥99.7%。 DNA 分子量标准（DNA marker）：可以清楚区分 100 bp～600 bp 的 DNA 片段。 2×Taq Plus PCR 预混试剂：0.1 U/μL Taq Plus Polymerase、500 μM dNTP each、20 mM Tris-HCl(pH=8.3)、100 mM KCl、3 mM MgCl 、稳定剂、增强剂。 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 6.1.6 6.1.7 6.1.8 6.1.9 6.1.10 6.1.11 6.1.12 4 11 3 3 3 2 3 3 2 2 6.2 试剂配制 6.2.1 5×TBE 缓冲液 称取5.4 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.372 g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.75 g硼酸（6.1.3） 溶于70 mL纯水中，定容至100 mL，在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。 6.2.2 0.5×TBE 缓冲液 量取100 mL浓度5×TBE缓冲液（6.2.1）于烧杯中，加人900 mL纯水混匀。 6.2.3 CTAB 提取溶液 称取4 g十六烷基三甲基溴化铵（6.1.4）、16.38 g氯化钠（6.1.5）、1.21 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、 1.49 g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）溶于70 mL纯水，定容至200 mL，在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。 6.2.4 无菌纯水 纯水在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。 6.2.5 1%琼脂糖凝胶 2 — 称取1 g琼脂糖（6.1.6）溶于100 mL的0.5×TBE缓冲液（6.2.2），适当加热融化后加入10 µL Gel-Red 核酸染料（6.1.7），冷却至60℃倒入插好梳子的制胶槽中，冷却凝固。 DB45/T 2172 2020 7 仪器和设备 天平 精确至 mg 恒温 浴锅 高速冷冻离 机 高 扩增 平 系统 凝胶 像系统 7.1 电子 ： 0.1 。 7.2 水 。 7.3 心 ：最 15 000 7.4 PCR 仪。 7.5 水 电泳 。 7.6 成 。 rpm。 8 引物 正向引物：5’-CGCTCTGGTTCATCAACG-3’，反向引物：5’-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3’，预期扩增 片段大小为420 bp。 9 操作步骤 9.1 样品 采集或送检的甘蔗青叶片做好标识，于-18℃冰箱中保存备用。 9.2 DNA 的提取 取9.1中适量甘蔗叶片用自来水冲洗干净，再用纯水冲洗两遍，自然晾干后用不锈钢剪刀剪碎放入 研钵中，加入液氮（6.1.8）研磨成粉末状，分取100 mg放入1.5 mL离心管中，加入750 µL CTAB提取溶 液（6.2.3），涡旋振荡混匀后于65℃水浴45 min～60 min，期间每隔15 min颠倒离心管混匀；加入500 µL的三氯甲烷（6.1.9），颠倒混匀，12 000 rpm 离心3 min，转移上清液约0.5 mL至新离心管中，加入 等体积（0.5 mL）约4℃的无水乙醇（6.1.10），颠倒混匀，于-18℃冰箱中静置1 h，12 000 rpm 离心3 min，去上清，室温下干燥至乙醇挥发完全；加入50 µL无菌纯水（6.2.4）于4℃条件下保存备用。 注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。 9.3 PCR 扩增 9.3.1 PCR 反应体系 反 体系见表1。 PCR 应 试剂 无菌纯水 ×Taq Plus PCR预混试剂 2 表1 PCR 反应体系 终浓度 体积 - 6.5 µL 1 12.5 µL × 10 µmol/L正向引物 1.0 µmol/L 2.5 µL 10 µmol/L反向引物 1.0 µmol/L 2.5 µL 25 ng/µL DNA模板 1.0 ng/µL 1.0 µL 总体积 - 25.0 µL 3 — DB45/T 2172 2020 9.3.2 PCR 反应程序 预变性94℃，4 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35次循环；延伸反应72℃，10 min。 9.3.3 PCR 产物电泳检