ICS 07.100 B 50 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4092—2020 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求 The general technical requirements of separation and identification of fish intestinal microorganism 2020 - 08 - 20 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 09 - 20 实施 发 布 DB37/T 4092—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省海洋局提出并组织实施。 本标准由山东省海洋标准化技术委员会归口。 本标准负责起草单位：青岛华大基因研究院、青岛市标准化研究院。 本标准主要起草人：刘姗姗、乔雪松、王裕宽、王萌萌、杨恒加、王琛、陈建威、苏小珊、翟越、 许静、赵丹。 I DB37/T 4092—2020 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求 1 范围 本标准规定了鱼类肠道微生物样本的采集、分离、培养、鉴定及保藏等。 本标准适用于淡水及海水鱼类肠道微生物的研究。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 30744 深海微生物样品前处理技术规范 SN/T 2632 微生物菌种常规保藏技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肠道微生物 intestinal microorganism 生长于动物肠道，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。 3.2 16S rDNA 是编码16S rRNA的基因，16S rRNA为核糖体RNA的一个亚基，是系统分类研究中最常用的分子标签， 可被用于菌种鉴定。 3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA/RNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠 杆菌或酵母菌等生物体。 3.4 Sanger测序 Sanger sequencing 即双脱氧链终止法测序，为第一代DNA测序技术，是一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英 国生物化学家弗雷德里克•桑格于1977年发明。 4 缩略语 1 DB37/T 4092—2020 下列缩略语适用于本文件。 PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） OD：光密度（Optical Density） 5 基本要求 5.1 实验室通用要求 实验室应满足GB 19489中关于一级或以上级别生物安全实验室的要求。 5.2 鱼类样本要求 鱼类样本应尽量保证鲜活，死亡鱼类样本最长死亡时间不应超过24 h。 5.3 实验用具准备 一次性无菌手套、无菌眼科镊、无菌眼科剪、无菌PBS（配方见附录A.1）、2216E培养基(配方见附 录A.2)、LB培养基（配方见附录A.3）、无菌水、无菌50 mL离心管、医用托盘、75 %消毒酒精、涂布棒 等。 6 鱼类肠道微生物样本采集和保存 6.1 鱼类肠道微生物样本采集与储存 6.1.1 活体鱼类样本应先进行麻醉，之后，在超净工作台内，用 75 %的酒精对鱼体擦拭消毒。 6.1.2 将鱼类样品从泄殖腔处沿腹部剖开，用无菌 PBS 冲洗鱼类腹部，用吸水纸擦拭腹腔。 6.1.3 分离并剪下鱼类完整肠道，将肠道内容物全部挤到无菌离心管中，并将肠道内壁残留物轻刮于 离心管中。 6.1.4 对肠道内容物进行称重，内容物总质量应控制在 10 g 以下，按 1 g 内容物加入 3 mL 无菌 PBS 的 比例进行稀释，震荡混匀，得到肠道微生物样本。 6.2 肠道微生物样本存储 肠道微生物样本应储存在2 ℃～8 ℃低温环境下，宜立即进行处理，保存期限不应超过一周。 7 鱼类肠道可培养微生物的分离、培养及鉴定 7.1 肠道微生物分离和纯化 7.1.1 肠道微生物分离 -1 7.1.1.1 取 100 μL 肠道微生物样本，用无菌 PBS 稀释到 1 000 μL，制成 10 样品稀释液，震荡混匀， 备用。 -1 -2 7.1.1.2 取 100 μL 10 样品稀释液，用无菌 PBS 稀释到 1 000 μL，制成 10 样品稀释液，震荡混匀， 备用。 -3 -4 7.1.1.3 按上述步骤依次稀释获得 10 、10 的样品稀释液，震荡混匀，备用。 2 DB37/T 4092—2020 -2 -3 -4 7.1.1.4 取 10 ，10 ，10 样品稀释液进行固体培养基平板涂布，涂布平板宜 28 ℃恒温培养，培养时 间 1～3 天，每隔 12 h 观察菌落生长状态。 7.1.2 肠道微生物纯化 7.1.2.1 观察涂布平板的生长情况及菌落形态特征，选择合适稀释度（约 10～200 个菌落）的平板挑 选菌落，选择不同形态的单菌落编号后划线，于 28 ℃恒温培养 12 h～24 h。 7.1.2.2 观察划线培养菌落形态特征是否单一，对于形态结构不单一的平板继续挑单菌落并划线培养， 直至获得菌落形态特征一致的纯培养单菌，并填写《菌落形态特征统计表》，参见附录 B。 7.2 肠道微生物培养 挑取分离、纯化出的纯培养单菌落接种至液体培养基中，宜150 rpm 28 ℃条件下恒温震荡培养至菌 液OD 600值达到0.6～1.0之间。 7.3 肠道微生物鉴定 7.3.1 微生物基因组提取 对培养得到的菌液进行基因组提取，参照GB/T 30744内相关内容进行。 7.3.2 基因组 16S rDNA 基因扩增 对所提取菌株基因组的16S rDNA基因进行PCR扩增， 扩增引物及反应条件详见附录C。 7.3.3 PCR 产物电泳检测 对扩增所得PCR产物进行电泳检测，步骤参见附录D。 7.3.4 PCR 产物测序及序列比对 对检测合格的PCR产物进行Sanger测序，测序结果与EzBioCloud数据库进行序列比对，确定分离微 生物的种类并参考附录E的信息记录表进行记录。 7.3.5 其他情况 对于测序比对没有结果的菌株，可进行生化鉴定，包括镜检、革兰氏染色、接触酶试验、氧化酶试 验等，根据实验结果鉴定菌株种属类别。 8 鱼类肠道微生物的保藏 8.1 肠道微生物保藏 菌种保藏参见SN/T 2632规范内容。 8.2 保藏微生物信息记录 参照附录E的信息记录表，对保藏信息进行记录。 3 DB37/T 4092—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 缓冲液及培养基配方 表A.1给出PBS配方。 表A.1 PBS 配方 NaCl 8g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g 蒸馏水 定容至 1 000 mL pH 值 7.4 表A.2给出2216E培养基配方。 表A.2 2216E 培养基配方 蛋白胨 5g 酵母膏 1g FePO4 0.01 g 陈海水 定容至 1 000 mL 琼脂糖（固体培养基添加） 15 g pH 值 7.6 注：适用海水鱼肠道微生物培养 表A.3给出LB培养基配方。 表A.3 LB 培养基配方 蛋白胨 10 g 酵母膏 5g NaCl 10 g 蒸馏水 定容至 1 000 mL 琼脂糖（固体培养基添加） 15 g pH 值 7.6 注：适用淡水鱼肠道微生物培养 4 DB37/T 4092—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 菌落形态特征统计表 表B.1给出菌落形态特征统计表。 表B.1 菌落形态特征统计表 菌种编号 颜色 大小 形状 质地 有无 有无 是否 是否 是否 晕圈 光泽 湿润 凸起 透明 培养时间 记录人 5 DB37/T 4092—2020 CC 附 录 C （规范性附录） 菌液 PCR 表C.1给出PCR反应引物序列。 表C.1 PCR 反应引物序列 引物名称 序列 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGCTACCTTGTTACGACTT 表C.2给出PCR反应体系。 表C.2 PCR 反应体系（25 μL） 用量 组分 μL 无菌水 17.2 10×PCR Buffer 2.5 dNTP 2.0 27F 1.0 1492R 1.0 Taq 酶 0.3 模板（菌液） 1.0 表C.3给出PCR反应时间。 表C.3 PCR 反应时间 温度 时间 循环 94 ℃ 5 min 1 个循环 94 ℃ 30 s 55 ℃ 1 min 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10 min 1 个循环 4℃ ∞ 1 个循环 30 个循环 6 DB37/T 4092—2020 DD 附 录 D （规范性附录） 电泳测试 D.1 材料准备 Loading buffer，纯化PCR样品，DL2000 Marker，琼脂糖，TAE缓冲液，SYBR Safe染料，凝胶托盘， 电泳槽，凝胶用梳子。 D.2 电泳检测 配制1.5 %浓度（w/v）琼脂糖凝胶（小托盘一般需30 mL，中托盘需50 mL，大托盘需100 mL），以4 μ L/100 mL的量加入SYBR Safe染料。吸取Loading buffer、纯化PCR样品各2 μL，混匀。待凝胶冷却后， 放入电泳槽。各梳孔内加入3 μL混合样品，加入3 μL Marker，接通电源，调节电压至120 V～200 V进 行跑凝胶电泳。 D.3 凝胶成像 将凝胶电泳放入凝胶成像仪成像观察。 D.4 产物验证 观察电泳条带是否单一、条带是否明亮、产物大小是否为1 500 bp左右， 若满足上述要求，则表明 PCR成功。对于没有成功的样品可再次进行PCR验证，或将保藏的菌液进行活化，培养后再次进行PCR。 7 DB37/T 4092—2020 EE 附 录 E （规范性附录） 菌株信息记录表 表E.1给出菌株信息记录表。 表E.1 菌株信息记录表 鱼种信息 鱼种 鱼编号 采集日期 获取方式 采集地点 样品状态 保藏人 备注 菌株16S rDNA鉴定及保藏信息 菌株编号 Top-hit taxon Top-hit strain Similarity % 保藏时间 保藏方式 保藏孔位 注：鱼种编号和菌株编号可根据自身需要进行