ICS 65.150 B 51 DB32 江 苏 地 方 标 准 DB32/T 3771—2020 渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of quinolones in aquaculture water by LC-MS/MS 2020 - 04 - 08 发布 江苏省市场监督管理局 2020 - 05 - 15 实施 发 布 DB32/T 3771—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业农村厅提出。 本标准由江苏省渔业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：江苏省淡水水产研究所、江苏省水产质量检测中心。 本标准主要起草人：孟勇、沈美芳、朱晓华、杨洪生、王静、张美琴、谭秀慧、刘崇万、王凯、朱 凛。 I DB32/T 3771—2020 渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了渔业养殖用水中16种喹诺酮类抗生素残留量的前处理和液相色谱-串联质谱测定方 法。 本标准适用于渔业养殖用水中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、 依诺沙星、洛美沙星、萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、丹诺沙星、双氟沙星、奥比沙星、司帕沙星、氟罗沙 星16种抗生素残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 水样用混合纤维素滤膜过滤后，喹诺酮类抗生素经固相萃取柱富集、洗脱和净化后，供液相色谱串联质谱仪测定，内标法定量。 4 试剂和材料 4.1 甲醇（CH3OH）。 4.2 乙腈（CH3CN）。 4.3 甲酸（HCOOH）。 4.4 乙酸铵（CH3COONH4）。 4.5 氨水（NH3·H2O）：优级纯。 4.6 5 mmol/L 乙酸铵缓冲液：称取 0.1925 g 乙酸铵（4.4），溶于 500 mL 水中。用甲酸（4.3）调节 pH 为 3±0.05。 4.7 5%氨水甲醇溶液：量取5 mL氨水（4.5），用甲醇稀释并定容至100 mL。 4.8 0.1%甲酸水溶液：量取 1 mL 甲酸（4.3），用水稀释至 1000 mL。 4.9 0.1%甲酸水-乙腈：（9+1，体积比），量取 90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和 10mL 乙腈（4.2）混 合。 4.10 标准物质：恩诺沙星（Enrofloxacin）、诺氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、环 丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依诺沙星（Enoxacin）、 洛美沙星（Lomefloxacin）、萘啶酸（Nalidixic acid）、恶喹酸（Oxolinic acid）、氟甲喹（Flumequine）、 丹诺沙星（Danafloxacin）、双氟沙星（Difloxacin）、奥比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、 氟罗沙星（Fleroxacin），纯度≥97.0%。 1 DB32/T XXXX—2020 4.11 内标物质：氘代诺氟沙星，氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星，纯度≥97.0%。 4.12 喹诺酮类标准储备溶液：分别称取适量喹诺酮类标准品（4.10），用甲醇(4.1)溶解并定容至 10 mL， 使各种喹诺酮的浓度均为 1.0 mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期 6 个月。 4.13 内标标准储备溶液：分别称取适量内标标准品（4.11），用甲醇(4.1)溶解并定容至 10 mL，使各 种内标浓度均为 1.0 mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期 6 个月。 4.14 混合标准中间溶液：分别量取适量标准储备溶液(4.12)于 100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释配制 成浓度为 1 µg/mL 的混合标准中间溶液。-18℃以下避光保存，有效期 3 个月。 4.15 混合标准工作溶液：根据需要用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）由混合标准中间液（4.14）稀释成合适 的混合标准工作溶液，现配现用。 4.16 混合内标标准工作溶液：分别量取适量标准储备溶液(4.13)于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释 配制成浓度为1 µg/mL的混合内标标准工作溶液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。 注：除另有说明外，以下所用的试剂均为色谱纯，试验用水为GB/T 6682 规定的一级水。 仪器和设备 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)。 天平：感量 0.01 g。 分析天平：感量 0.00001 g。 涡旋混合器。 氮吹仪。 pH计：测量精度±0.05。 刻度玻璃离心管：10 mL。 混合纤维素滤膜：0.45 µm。 水系滤膜：0.22 µm。 固相萃取柱：HLB 固相萃取柱：500 mg，6 mL，或性能相当者。 固相萃取装置。 样品制备与保存 6 采集的渔业养殖水样经0.45 µm混合纤维素滤膜过滤。如水样较浑浊，可更换滤膜或过滤2次。过滤 后的水样于4℃密封保存，24 h内进行检测。 ——取过滤后的供试样品，作为供试试料。 ——取过滤后的空白样品，作为空白试料。 ——取过滤后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。 测定步骤 7 7.1 提取和净化 依次用6 mL甲醇，6 mL超纯水，6 mL 5 mmol/L乙酸铵缓冲液（4.6）活化小柱（5.10）。量取200 mL 过滤后的试样，加入适量甲酸调节水样pH为3.0±0.05，准确加入1µg/mL混合内标标准工作液50 µL （4.16）。然后以约3~5 mL/min流速通过固相萃取柱（5.10）。过柱后用6 mL超纯水淋洗，再将小柱于 氮气保护下干燥20 min，最后用6 mL5%氨水甲醇溶液（4.7）分两次进行洗脱。洗脱液于40℃水浴用氮 2 DB32/T 3771—2020 气吹至近干，用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）定容至1 mL，涡旋混匀1 min，过0.22 µm水系滤膜，供液相色 谱-串联质谱仪测定。 7.2 标准曲线的制备 精确量取适量混合标准中间溶液(4.14)和适量 1 µg/mL 混合内标标准工作液（4.16），用 0.1%甲酸 水-乙腈（4.9）配制成同位素内标浓度为 50 ng/mL 以及 16 种喹诺酮浓度为 1、5、10、20、50、100 和 200 ng/mL 系列标准溶液。以被测组分和相应内标的峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲 线，计算回归方程和相关系数。 7.3 测定 7.3.1 色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a) 色谱柱：EC-C18 柱，(2.1 mm x100 mm，2.7 µm)，或性能相当者。 b) 流速：0.40 mL/min。 c) 柱温：30℃。 d) 进样量：10 µL。 e) A 为 0.1%甲酸水溶液 (4.8)，B 为乙腈(4.2)；梯度洗脱程序见表 1。 表 1 流动相梯度洗脱程序 7.3.2 时间/min A相/% B相/% 0.00 95 5 2.00 85 15 10.00 45 55 12.00 10 90 13.00 95 5 15.00 95 5 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式； b) 喷雾电压：5500 v； c) 气帘气流量：2 L/min； d) 雾化气流量：8 L/min； e) 辅助加热气流量：8 L/min； f) 离子源温度：500℃； g) 扫描模式：多反应监测(MRM)，扫描参数见附录 A； 7.3.3 定性测定 在同样测试条件下，试样溶液中各抗生素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±2.5%以内， 且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致。基峰与次强 碎片离子丰度比应符合表 2 要求。各抗生素的保留时间参考附录 B。 3 DB32/T XXXX—2020 表 2 基峰与次强碎片离子丰度比要求 次强碎片离子相对丰度 % ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≤10 允许相对偏差 % ±20 ±25 ±30 ±50 7.3.4 定量测定 将标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按内标法进行定量分析，在样品中加入回收率指示物， 以此来保证整个样品前处理过程的回收率。诺氟沙星、依诺沙星以氘代诺氟沙星为内标，环丙沙星、 洛美沙星以氘代环丙沙星为内标，恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、 双氟沙星、恶喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟罗沙星、奥比沙星以氘代恩诺沙星为内标。 7.3.5 空白试验 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。 结果计算 8 试样中喹诺酮类抗生素含量按公式(1)计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字。 Xi  ci  V m ………………………………………………………（1） 式中： Xi — 试样中喹诺酮类抗生素含量，单位为纳克每升(ng/L)； ci — 试样溶液中喹诺酮类抗生素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； V1 — 试样溶液最终体积，单位为毫升(mL)； m — 试样体积，单位为升(L)。 方法灵敏度、准确度和精密度 9 9.1 灵敏度 本方法的定量限为10 ng/L。 9.2 准确度 本方法回收率范围为70%～120%。 9.3 精密度 本方法的批内变异系数≤15%，批间变异系数≤15%。 4 DB32/T 3771—2020 附 录 A （资料性附录） 扫描参数 表A.1 16种喹诺酮类抗生素及内标物的母离子、子离子和碰撞能量 序号 化合物 母离子/(m/z) 子离子/(m/z) 碰撞能量/V 1 恩诺沙星 360 245 38 316* 26 2 诺氟沙星 320 233 35 276* 26 3 培氟沙星 334 290 27 316* 30 4 环丙沙星 332 245 32 288* 26 5 氧氟沙星 362 261 26 318* 38 6 沙拉沙星 386 299 36 342* 26 7 依诺沙星 321 232 44 303* 30 8 洛美沙星