ICS 65.020.20 B 05 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2272—2020 杭白菊脱毒种苗生产技术规程 Technical regulations for virus-free plantlets of Chrysanthemum morifolium 2020 - 08 - 26 发布 2020 - 09 - 26 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 2272—2020 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江大学、浙江省农业技术推广中心、浙江省中药材产业协会、嘉兴市农业科学 研究院桐乡农业科学研究所。 本标准主要起草人：毛碧增、颜克如、何伯伟、马常念、谢礼、张亚惠、冯明慧、陆中华、缪悦啸、 朱卫东、周建松、戴德江、沈子尧、刘辉辉、杨传宝、何家浩。 1 DB33/T 2272—2020 杭白菊脱毒种苗生产技术规程 1 范围 本标准规定了杭白菊脱毒苗的定义、生产技术、分级与质量要求、检测方法和包装、标志、运输与 贮存。 本标准适用于不携带菊花 B 病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y， PVY）等的脱毒组培瓶苗、脱毒原种苗及脱毒生产用苗。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 191 包装储运图示标志 GB/T 18862 地理标志产品 杭白菊 NY/T 401 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程 NY 525 有机肥料 SN/T 2122-2015 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 杭白菊 系菊科植物菊 (Chrysanthemum morifolium Ramat.) 产于浙江省的药用栽培杭菊，以干燥头状花序入 药。 3.2 脱毒苗 经植物脱病毒方法获得或引进，经检测后确认不携带本标准规定检测病毒的种苗。 3.2 脱毒组培瓶苗 通过植物脱病毒方法获得的不携带本标准规定检测病毒的组织培养瓶苗。 3.3 2 DB33/T 2272—2020 脱毒原种苗 脱毒组培瓶苗移栽于无病原、虫源的种苗圃内存活的植株。 3.4 脱毒生产用苗 由脱毒原种苗定植于无病原、虫源的种苗圃内通过扦插或压条繁殖的植株。 3.5 脱毒率 不携带本标准规定检测病毒的植株数占所检测植株总数的百分比。 4 生产技术 4.1 脱毒组培瓶苗 4.1.1 外植体选择 选择品种特性纯正、品质优良、丰产性能好、无病虫害的植株。采样最佳时间为10月～11月晴天的 10:00～16:00，切取带生长点的2 cm～3 cm茎段。 4.1.2 无菌苗繁育 茎段经无菌水清洗后置于超净工作台，切取带生长点的茎段1 cm～2 cm，用70%～75%的乙醇冲洗表 面1 min后，经次氯酸盐和Tween-20消毒8 min～10 min，并不断摇动，最后用无菌水冲洗5次～8次，用 无菌滤纸吸干水分，剥取0.3 mm～0.5 mm的茎尖分生组织，接种于生长培养基中。 4.1.3 脱毒苗培育 无菌植株培养至1.5 cm～2.0 cm时，置于解剖镜下挑取0.3 mm～0.5 mm的茎尖分生组织，接种于茎 尖培养基中，植株长到3 cm～6 cm时接种于生根培养基。 4.1.4 脱毒苗快繁 经病毒检测合格的试管苗，植株长至6 cm～8 cm时，切取含有1个～2个节间的茎段进行扩繁。接种 到增殖培养基中，每20 d～30 d继代1次。继代控制在4代～6代。 4.1.5 培养条件 -2 -1 -2 -1 光照强度30 μmol·m ·s ～60 μmol·m ·s ，白天温度25℃±2℃，晚上温度18℃±2℃（黑暗培养）。 每天照光12 h～14 h。 4.2 脱毒原种苗和脱毒生产用苗 4.2.1 脱毒原种苗生产 4.2.1.1 基质准备 建议基质栽培。基质配比为泥炭:珍珠岩:蛭石=3:1:1（体积比）。 3 DB33/T 2272—2020 4.2.1.2 定植方式 打开脱毒瓶苗的瓶盖，置于太阳光非直射处，常温驯化 1 d～2 d 后洗净琼脂，种植于苗床、营养 钵或穴盘中，栽后浇透水，第 1 周用遮光率为 50%的遮阳网遮荫，并保持相对湿度 75%～90%。宜使用防 虫网隔离。 4.2.2 脱毒生产用苗繁殖 4.2.2.1 苗床准备 2 定植前施足基肥，每667 m （亩）施入有机肥200 kg～300 kg，有机肥应符合NY 525标准，高浓 度三元复合肥15 kg。按畦宽1.2 m～1.5 m，沟宽30 cm～35 cm，沟深25 cm～35 cm，整地作畦。 4.2.2.2 繁殖方式 4.2.2.2.1 生产用苗的繁殖可以采用扦插繁殖或压条繁殖。 4.2.2.2.2 扦插繁殖：脱毒原种苗株高30 cm以上时，用消毒刀具剪取带有3个～5个节的8 cm～10 cm 茎段，茎段基部扦插于苗床、营养钵或穴盘，栽后浇透水，用遮光率为50%的遮阳网遮荫，相对湿度保 持75%～90%，等茎段基部发出根，掀开遮阳网。 4.2.2.2.3 压条繁殖：苗床上的脱毒原种苗株高40 cm～50 cm时，用土块进行“压条”,将枝条平放于 畦面，每隔20 cm～25 cm用土块压住枝条，节间萌发不定根和不定芽。 4.2.2.2.4 脱毒种苗繁育脱毒生产用苗，繁殖年限控制在3年～4年。 5 分级与质量要求 5.1 脱毒苗按繁育过程可分为脱毒组培瓶苗、脱毒原种苗和脱毒生产用苗三类。 5.2 脱毒组培瓶苗按质量要求分为优质苗和合格苗。 5.3 脱毒组培瓶苗、脱毒种苗的质量等级指标、检验方法、检验规则参见附录 A。 6 抽样与检测方法 6.1 抽样 脱毒组培瓶苗抽样按 NY/T 401 规定执行，脱毒原种苗和脱毒生产用苗的抽样按 SN/T 2122-2015 中 的 5.2 执行。 6.2 检测方法 病毒检测方法参见附录B。 7 包装、标志、运输与贮存 7.1 包装 组培瓶苗和脱毒种苗宜用塑料箱或纸板箱包装。 7.2 标志 4 DB33/T 2272—2020 包装箱内附脱毒苗出厂（圃）合格证，病毒检测报告参见附录C；外面应注明标准号、生产单位的 地址和联系电话，其他按GB/T 191的规定执行。 7.3 运输 运输过程中应控温控湿，温度以15℃～25℃为宜，相对湿度以60%～90%为宜。 7.4 贮存 组培瓶苗常温弱光照条件下可以贮存7 d～10 d，脱毒种苗出圃后3 d内定植。 8 标准化生产模式图 杭白菊标准化生产模式图参见附录D。 5 DB33/T 2272—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 脱毒组培瓶苗、脱毒种苗的质量要求、检验方法、检验规则 A.1 质量要求 A.1.1 脱毒组培瓶苗质量等级指标 脱毒组培瓶苗质量等级指标见表 A.1。 表 A.1 脱毒组培瓶苗质量等级指标 项 指 目 标 优质苗 合格苗 株高，cm 6.0～10.0 4.0～6.0 茎粗，mm ≥3.0 1.0～3.0 脱毒率，% 100 100 外观要求 生长健壮、根系发达、无污染、无病斑 A.1.2 脱毒种苗质量等级指标 脱毒种苗质量等级指标见表 A.2。 表 A.2 脱毒种苗质量等级指标 项 目 脱毒率，% 外观要求 指 标 脱毒原种苗 脱毒生产用苗 100 ≥95 种苗生长健壮、根系发达、无外源病害、茎粗 ≥3 mm A.2 检验方法 株高用分度值1 mm的直尺测量，茎粗用游标卡尺测量。 A.3 检验规则 A.3.1 组批规则 同一时间，同一地点，取得同一品种不同单株的外植体经过组织培养培育的脱毒苗为同一检验批次。 A.3.2 检验分类 A.3.2.1 出厂（圃）检验 6 DB33/T 2272—2020 由厂家执行检验组培瓶苗和脱毒种苗的株高和茎粗。并附有菊花脱毒苗出厂（圃）合格证。 A.3.2.2 型式检验 型式检验是对本标准所规定的全部要求进行检验。在正常生产时，每年进行一次。新建厂家和改变 工艺程序时也应进行型式检验。 A.4 判定原则 检验结果全部符合本标准的，则判定该批次为合格种苗或优质苗。否则，则判定该批次种苗为不合 格。 7 DB33/T 2272—2020 BB 附 录 B （资料性附录） 杭白菊脱毒种苗规定检测的病毒种类和检测方法 B.1 检测病毒种类 菊花 B 病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）、 烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和马 铃薯 Y 病毒（Potato virus Y， PVY）。 B.2 病毒检测方法 采用双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)、聚合酶链反应(PCR)和电镜观察等方法检测，在生产上 只需采用其中一种。仲裁时采用聚合酶链反应 (PCR)检测法。 B.2.1 双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测法 检测方法按NY/T 401-2000中附录A的方法执行。 B.2.2 聚合酶链反应(PCR) 检测法 B.2.2.1 菊花B病毒 菊花B病毒是单分体线形正义ssRNA病毒。取各编号植株的叶片，提取总RNA，利用寡聚胸腺嘧啶T 引 物 oligo-dT 将 RNA 反 转 录 为 cDNA ， 用 菊 花 B 病 毒 的 特 异 引 物 （ 上 游 引 物 5 ’ -ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3’和下游引物5’-TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’）进行聚合酶 链反应（Polymerase chain reaction, PCR）。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min后进入循环：94 ℃ 变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，扩增得到650 bp的片 段。扩增产物经回收纯化后，用T4 DNA连接酶与pGEM-T载体