ICS 11.020 C 62 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.11—2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 11 部分：全基因组高通量测序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 11: Whole genome high-throughput sequencing 2020 - 07 - 29 发布 江苏省市场监督管理局 2020 - 07 - 30 实施 发 布 DB32/T 3762.11—2020 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估； ——第10部分：微量血清中和试验； ——第11部分：全基因组高通量测序。 本部分为DB32/T 3762 的第11部分。 本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：崔仑标、葛以跃、赵康辰、朱小娟、朱宝立、程军平、钱志远、罗晓明、沈欢 喜。 I DB32/T 3762.11—2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 11 部分：全基因组高通量测序 1 范围 本部分规定了新型冠状病毒全基因组高通量测序的环境与设施、设备与耗材、试剂、样本前处理与 核酸提取、全基因组测序、结果分析。 本部分适用于新型冠状病毒全基因组高通量测序。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 医疗机构临床基因扩增管理办法 原卫生部办公厅 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原卫生部检验中心 国家卫生计生委对高通量测序试点实验室的要求 原国家卫生计生委 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 全基因组测序 whole genome sequencing 对生物体整个基因组序列进行测定，以获得完整的基因组信息。 3.2 高通量测序 high-throughput sequencing 能 一 次 并 行 对 几 十 万 到 几 百 万 条 DNA 分 子 进 行 序 列 测 定 的 技 术 ， 又 称 “ 下 一 代 ” 测 序 （"next-generation" sequencing）或深度测序（deep sequencing）技术。 3.3 Reads 高通量测序平台产生的序列称为reads，即测序读到的碱基序列片段，是测序的最小单位。 3.4 测序深度 sequencing depth 测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 1 DB32/T 3762.11—2020 3.5 测序覆盖度 sequencing coverage 测序得到的序列占整个基因组的比例。 4 环境与设施 4.1 实验室资质及级别要求 应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，未经培养的感染性材料的操作在采用可靠的 方法灭活前进行核酸提取及临床样本的灭活等操作，应在生物安全二级实验室（BSL-2）进行，同时采 用生物安全三级实验室（BSL-3）的个人防护；感染性材料或活病毒在采用可靠方法灭活后进行的核酸 检测操作应在BSL-2进行。cDNA制备后的相关操作可在生物安全一级实验室（BSL-1）进行。全基因组 测序实验室应符合GB 19489、《国家卫生计生委对高通量测序试点实验室的要求》、《医疗机构临床 基因扩增管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》相关要求。 4.2 操作人员资质及防护要求 实验操作人员应经过生物安全培训并取得实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下准入。样 本制备及核酸提取防护参照DB32/T 3762.3的第4章进行，测序相关操作采用BSL-1的个人防护。 5 设备与耗材 5.1 设备 PCR扩增仪、核酸提取仪、核酸定量仪、高通量测序仪。 5.2 耗材 微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、96孔板磁力架、1.5 mL EP管、0.2 mL 8联排管、96孔PCR板。 6 试剂 核酸提取试剂盒、核酸定量试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、随机六聚体引物、经验证可靠的适 合多重反应的PCR扩增试剂盒、DNA纯化磁珠、文库制备试剂盒、高通量测序试剂盒。 7 样本前处理与核酸提取 参照DB32/T 3762.3的第7章进行。 8 模板制备 8.1 cDNA 制备 以提取的核酸为模板，采用第一链cDNA合成试剂盒和随机六聚体引物，根据试剂盒说明书在PCR 扩增仪上制备第一链cDNA。 2 DB32/T 3762.11—2020 8.2 混合引物 8.2.1 将所有扩增引物（附录 A）配置为 100µM 储存浓度，将 49 对 Pool 1 的引物各取 5µL 混匀，得 490µL Pool 1 引物池（引物总浓度为 100µM），同样将 49 对 Pool 2 的引物各取 5µL 混匀，得 490µL Pool 2 引物池（引物总浓度为 100µM）。 8.2.2 以去离子水分别将 Pool 1 和 Pool 2 引物池作 10 倍稀释，使其引物总浓度均为 10µM，分装后储 存以防止污染和降解。 8.3 多重 PCR 扩增 8.3.1 采用 PCR 扩增试剂盒，根据试剂盒说明书配置多重 PCR 扩增体系，反应体系中每一条引物的 终浓度为 0.015µM，Pool 1 和 Pool 2 各配置一套扩增体系，每 25µL 反应体系中加入 2µL cDNA 模板。 8.3.2 按以下参数进行 PCR 扩增：98℃ 30s；98℃ 15s，65℃ 5min，扩增 30 循环；4℃ hold。 8.4 PCR 产物的纯化 8.4.1 将每一份样本的 Pool 1 扩增产物和 Pool 2 扩增产物混合于新的 8 联排 PCR 管或 96 孔 PCR 板中。 8.4.2 采用 DNA 纯化磁珠法对混合后的扩增产物进行纯化，以 30µL TE buffer (10 mM tris-HCl pH8.0, 0.1 mM EDTA)洗脱纯化后的产物。 9 DNA 文库构建 9.1 纯化产物的定量与标化 使用核酸定量试剂盒对纯化产物进行双链DNA定量，根据所使用建库试剂盒说明对其进行标化。 9.2 DNA 文库制备与混合 根据所使用的建库试剂盒说明书进行文库制备、定量和文库混合。 10 上机测序 根据高通量测序试剂盒和高通量测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序。 11 结果分析 可采用不同的生物信息学软件进行测序结果的分析：首先去除测序数据中的PCR引物序列（按照最 大引物长度 30bp进行Trim） 和低质量的Reads，然后以 SARS-CoV-2 参 考基因组（GeneBank号： MN908947.3）为模板进行序列mapping，mapping之后对测序覆盖度和测序深度进行分析，最终生成一 致性（consensus）序列，即为待测样本的全基因组序列。 3 DB32/T 3762.11—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 多重 PCR 扩增引物序列 序号 引物名称 所属引物池 引物序列（5′-3′） 长度 1 nCoV-2019_1_LEFT Pool 1 ACCAACCAACTTTCGATCTCTTGT 24 2 nCoV-2019_1_RIGHT Pool 1 AAGTGCCATCTTTAAGATGTTGACG 25 3 nCoV-2019_2_LEFT Pool 2 CTGTTTTACAGGTTCGCGACGT 22 4 nCoV-2019_2_RIGHT Pool 2 TAAGGATCAGTGCCAAGCTCGT 22 5 nCoV-2019_3_LEFT Pool 1 CGGTAATAAAGGAGCTGGTGGC 22 6 nCoV-2019_3_RIGHT Pool 1 AAGGTGTCTGCAATTCATAGCTCT 24 7 nCoV-2019_4_LEFT Pool 2 GGTGTATACTGCTGCCGTGAAC 22 8 nCoV-2019_4_RIGHT Pool 2 CACAAGTAGTGGCACCTTCTTTAGT 25 9 nCoV-2019_5_LEFT Pool 1 TGGTGAAACTTCATGGCAGACG 22 10 nCoV-2019_5_RIGHT Pool 1 ATTGATGTTGACTTTCTCTTTTTGGAGT 28 11 nCoV-2019_6_LEFT Pool 2 GGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCG 22 12 nCoV-2019_6_RIGHT Pool 2 TAGCGGCCTTCTGTAAAACACG 22 13 nCoV-2019_7_LEFT Pool 1 ATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTA 22 14 nCoV-2019_7_RIGHT Pool 1 TGCACAGGTGACAATTTGTCCA 22 15 nCoV-2019_8_LEFT Pool 2 AGAGTTTCTTAGAGACGGTTGGGA 24 16 nCoV-2019_8_RIGHT Pool 2 GCTTCAACAGCTTCACTAGTAGGT 24 17 nCoV-2019_9_LEFT Pool 1 TCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGA 24 18 nCoV-2019_9_RIGHT Pool 1 TTTATGACAGCATCTGCCACAA 22 19 nCoV-2019_10_LEFT Pool 2 TGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGT 24 20 n