ICS 65.150 B 51 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3802—2020 南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应 (PCR)检测方法 Detection of Enterocytozoon hepatopenaei in Litopenaeus vannamei by nested PCR 2020 - 05 - 25 发布 江苏省市场监督管理局 2020 - 06 - 25 实施 发 布 DB32/T 3802—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：江苏省海洋水产研究所。 本标准主要起草人：万夕和、沈辉、乔毅、史文军、王李宝、黎慧、蒋葛、成婕、范贤平。 I DB32/T 3802—2020 南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法 1 范围 本标准规定了南美白对虾（Litopenaeus vannamei）肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP） 巢式聚合酶链式反应（polymerasw chain reation，PCR）检测方法的原理、试剂材料、仪器设备、操作 步骤和结果判定。 本标准适用于南美白对虾样品中肝肠孢虫带虫情况的高灵敏定性检测。 其他环境生物和饵料生物，以及非生物样品中肝肠胞虫带虫情况检测可参照此方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 25878—2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测 PCR 法 SC/T 7202.2—2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第 2 部分：PCR 检测法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肝肠胞虫 Enterocytozoon hepatopenaei 一种感染对虾肝胰腺、肠道等器官的微孢子虫，可致南美白对虾生长缓慢，养殖产量严重下降。 4 技术原理 南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应（PCR)检测方法是以样品 DNA 为模板，针对其胞壁蛋白 基因设计两对特异性巢式寡核苷酸序列为引物，在四种脱氧核糖苷三磷酸存在下，利用 DNA 聚合酶的 合成作用，经过先后两步数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两对引物间的 DNA 片段 得到特异性巢式扩增，通过电泳检测扩增片段是否存在。 5 试剂材料 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。 实验用水为无菌蒸馏水或超纯水。 无水乙醇。 液体石蜡。 二氧化氯消毒剂。 1 DB32/T 3802—2020 5.6 电泳琼脂糖。 5.7 1 kb DNA Marker。 5.8 Tris 平衡酚。 5.9 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）。 5.10 10×PCR 缓冲液，无 Mg2+，随 Taq DNA 聚合酶提供。 5.11 氯化镁溶液（25 mmol/L）。 5.12 dNTP（含 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 10 mmol/L 的混合物）。 5.13 20 mg/mL 蛋白酶 K。 5.14 TE 缓冲液、抽提缓冲液、1×电泳缓冲液、6×载样缓冲液。 5.15 10 mol/L 乙酸铵。 5.16 酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）。 5.17 核酸染料。 5.18 70%乙醇。 5.19 阳性对照为已知受 EHP 感染的南美白对虾样品；阴性对照为已知未受 EHP 感染的南美白对虾样 品；空白对照为无菌双蒸水。 6 仪器设备 所需仪器设备按照 SC/T 7202.2—2007 中第 6 章的规定。所有非一次性使用的器具应经清洗，浸于 新配制的有效氯 3.0×10-3 的二氧化氯消毒剂中 5 min，经无 PCR 产物污染的蒸馏水或超纯水充分淋洗干 净后方可用于检测。 7 操作步骤 7.1 样品准备 取活体或冰冻南美白对虾或其他生物样品 50 mg～100 mg（环境沉积物样品约 500 mg），放入灭 菌的 1.5 mL 离心管中，避免样品间交叉污染。 7.2 DNA 的提取 样品 DNA 的提取参照 SC/T 7202.2—2007 中 7.1.3 执行。 7.3 PCR 反应体系准备 7.3.1 巢式第一步 PCR 的反应的模板为抽提的样品 DNA，其反应预混物组成及反应条件见表 1。 2 DB32/T 3802—2020 表1 巢式第一步PCR反应预混物组成及反应条件 25 μL体系 50 μL体系 （μL） （μL） 2.5 5 2 4 0.5 1 dNTP(10 mmol/L) 1 2 100 ng/μL 引物F1：5’-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3’ 1 2 100 ng/μL 引物R1：5’-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3’ 1 2 Taq DNA聚合酶（5U/μL） 0.25 0.5 灭菌双蒸水 16.75 33.5 试剂 2+ 10×PCR缓冲液（无Mg ） MgCl (25mmol/L) DNA模板 扩增程序：95℃ 预变性5min；95℃ 30s、58℃ 30s、68℃ 45s，30次循环；68℃终延伸5min。4℃保温 产物大小：514bp 7.3.2 巢式第二步 PCR 的反应模板为稀释 1000 倍后的第一步 PCR 产物，反应预混物组成及反应条件 见表 2。 表2 巢式第二步PCR反应预混物组成及反应条件 25 μL体系 50 μL体系 （μL） （μL） 2.5 5 2 4 0.5 1 dNTP(10 mmol/L) 1 2 100 ng/μL 引物F2：5’-TTGGCGGCACAATTCTCAAACA-3’ 1 2 100 ng/μL 引物R2：5’-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3’ 1 2 Taq DNA聚合酶（5U/μL） 0.25 0.5 灭菌双蒸水 16.75 33.5 试剂 2+ 10×PCR缓冲液（无Mg ） MgCl2 (25mmol/L) DNA模板（第一步PCR产生稀释1000倍） 扩增程序：95℃ 预变性5min；95℃ 30s、64℃ 30s、68℃20s，20次循环；68℃终延伸5min。4℃保温。 产物大小：148bp 7.3.3 甲壳类动物内参基因 PCR 的反应模板为抽提的南美白对虾样品 DNA，其反应预混物组成及反应 条件见表 3。 3 DB32/T 3802—2020 表3 甲壳动物内参基因PCR反应预混物组成及反应条件 25 μL体系 50 μL体系 （μL） （μL） 2.5 5 2 4 0.5 1 dNTP(10 mmol/L) 1 2 100 ng/μL 引物F：5’-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3’ 1 2 100 ng/μL 引物R：5’-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3’ 1 2 Taq DNA聚合酶（5U/μL） 0.25 0.5 灭菌双蒸水 16.75 33.5 试剂 2+ 10×PCR缓冲液（无Mg ） MgCl2 (25mmol/L) DNA模板 扩增程序：94℃ 预变性5min；94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min，35次循环；72℃终延伸5min。4℃保温。 产物大小：848bp 7.3.4 分别配制好 100 份~1000 份第一步 PCR、第二步 PCR 和甲壳类动物内参基因 PCR 的无 Taq DNA 聚合酶的反应预混物，按 10 份/支、100 份/支对无酶反应预混物分别分装，冻存于-20℃。 7.3.5 检测前，取出所需份数的 PCR 无酶预混物解冻，按比例分别加入所需的 Taq 酶量，混匀；按 1 份/支将预混合物分别分装到 0.2 mL PCR 管中待用。 7.4 PCR 操作 7.4.1 巢式第一步 PCR 按照表 1 在含 Taq 酶的预混物 PCR 管中分别加入相应量样品 DNA、阳性对照、阴性对照和空白对 照模板，然后按扩增程序进行 PCR 反应。 7.4.2 巢式第二步 PCR 按照表 2 在含 Taq 酶的预混物 PCR 管中分别加入相应量稀释后的第一步 PCR 产物，然后按扩增程 序进行 PCR 反应。 7.4.3 甲壳类动物内参基因 PCR（除南美白对虾样本外，其他样本不执行此步骤） 按照表 3 在含 Taq 酶的预混物 PCR 管中分别加入相应量样品 DNA、阳性对照、阴性对照和空白对 照模板，然后按扩增程序进行 PCR 反应。 7.5 PCR 产物分析 7.5.1 琼脂糖凝胶制作 7.5.1.1 用 1×电泳缓冲液配制 1.5%的琼脂糖凝胶，装于 250 mL 三角瓶中，胶液体积应少于容器体积的 1/4，在电炉上或微波炉中加热至溶液完全透明。待溶液冷却至 60℃左右，按要求加入核酸染料，摇匀。 7.5.1.2 将凝胶液缓缓倒入设置好的水平放置的凝胶船，胶液厚度 0.6 cm～0.8 cm。梳底部水平深入胶 层约 0.3 cm～0.5 cm，并距凝胶底部 0.2 cm。 7.5.1.3 待凝胶完全凝固后，小心拔掉梳齿，去掉防漏条/套。 7.5.2 电泳 PCR 产物电泳参照 SC/T 7202.2—2007 中 7.1.6 执行。 7.5.3 结果的分析和问题排除 电泳结果的分析和问题排除方法参见 GB/T 25878—2010 附录 B。 4 DB32/T 3802—2020 8 结果判定 8.1 阳性对照、阴性对照和空白对照均检测准确的条件下检测结果有效（若样品为南美白对虾还需同 时满足甲壳动物内参基因有检出），若样品巢式第一步 PCR 产物在 514bp 处有特定条带，或巢式第一 步无特定条带但第二步 PCR 产物在 148bp 处有特定条带，该样品判定阳性，若两步 PCR 均无特定大小 条带判定为阴性。 8.2 条带的亮暗表示 PCR 产物数量的多少，但并不对应模板的量的多少。单独使用时不适用于对含虫 量和感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。 8.3 阳性结果表明样品中存在 EHP。活虾和敏感宿主阳性表明已受到 EHP 感染；对虾产品和其他产品 阳性表明曾受到 EHP 感染或受到 EHP 污染。 ______________________________ 5