ICS 65.020.01 CCS B 60 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3429—2021 蒙古栎 SSR 分析技术规程 Technical Regulations of SSR analysis in Quercus mongolica 2021- 05 - 22 发布 辽宁省市场监督管理局 2021 - 06 - 22 实施 发 布 目 前 次 言 ........................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 仪器设备及试剂 .................................................................... 1 5 引物 .............................................................................. 2 6 溶液配制 .......................................................................... 2 7 分析程序 .......................................................................... 2 附 录 A （资料性） .................................................................. 5 附 录 B （资料性） .................................................................. 6 附 录 C （资料性） .................................................................. 7 附 录 D （资料性） .................................................................. 8 I DB21/T 3429—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1的规则起草。 本文件由辽宁省林业和草原管理局提出并归口管理。 本文件起草单位：辽宁省林业科学研究院。 本文件起草人：陈罡、于世河、卜鹏图、郑颖、陆爱君、王占伟、王敬贤、庞忠义、赫亮、刘怡菲、 高旭、李昀峰、扈延伍、曹颖、刘金义、庞家举、许家铭、翟金凤、赵济川、战金伟。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（辽宁省沈阳市和平区太原北街2号），联系电话： 024-23448927。 文件起草单位通讯地址：辽宁省林业科学研究院（辽宁省沈阳市皇姑区鸭绿江街12号），联系电话： 024-82241813。 I I DB21/T 3429—2021 蒙古栎 SSR 分析技术规程 1 范围 本文件规定了蒙古栎SRR分析技术的定义和术语、仪器设备、溶液配制、引物和分析程序。 本文件适用于辽宁地区蒙古栎的SSR分析。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 28660 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记 LY/T 2426 枣品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 LY/T 2756 白蜡品种分子鉴定方法—SRAP 分子标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 简单重复序列 又称微卫星DNA，是一类由1～6个核苷酸为重复单位的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列。 3.2 聚合酶链式反应 在耐热 DNA 聚合酶作用下，于体外快速大量特意扩增待定 DNA 序列的方法。 3.3 引物 一条互补结合在模板 DNA 链上的短的单链，提供 3’-OH 末端作为 DNA 合成的起点，延伸合成模板 DNA 的互补链。 3.4 引物扩增多态性 一对引物在两个或两个以上不同材料基因组 DNA 之间扩增，得到数目不同或长度不同的 DNA 片段。 4 仪器设备及试剂 1 DB21/T 3429—2021 仪器设备及试剂见附录B。 5 引物 引物相关信息见附录C。 6 溶液配制 溶液配制方法见附录D。 7 分析程序 7.1 分析材料 采集蒙古栎新鲜幼嫩叶片为材料提取基因组DNA。选取适量样品装入冻存管，液氮速冻后置于-80℃ 超低温冰箱保存备用。 7.2 DNA 的提取 a) 采用 CTAB 法提取蒙古栎基因组 DNA。将干净研钵、研杵、小匙、无水乙醇预先放入冰箱中 -20 ℃预冷，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，再用滤纸吸干水分。 b) 取 5~10 g 叶片在液氮中迅速研磨成粉状，迅速转至灭过菌的 1.5 mL 离心管中，加入 500 μL 预热过（60 ℃）的 CTAB 提取液、5 μL 0.2% β-巯基乙醇和 5 μL RNase A(10 mg/mL)，充分混匀后 放入 65 ℃水浴 30 min。其间每隔 10 min 轻轻摇动混匀 2 次~3 次。 c) 取出离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀 10 min，再于台式冷冻离心机 上 10 000 g 离心 10 min。 d) 将上清液转入另一新的 1.5 mL 离心管中，重复 c)步骤 1~2 次。 e) 移取上清液至另一已加入 2 倍体积预冷（0℃以下）无水乙醇的 1.5 mL 离心管中，轻轻颠倒混 匀，使 DNA 沉淀成絮状，-20℃放置 30 min 以上。 f) 用钩状玻璃棒轻轻挑出絮状沉淀并置于新的 1.5 mL 离心管中。如果样品未出现云雾状沉淀或 看不清沉淀，10 000 g 离心 10 min，再收集沉淀。 g) 加入 1 mL~1.5 mL 70%无水乙醇浸泡洗涤沉淀，轻摇几分钟，10 000 g 离心 10 min，收集沉 淀，重复 1 次。然后将离心管水平放置在清洁场所晾干或在超净工作台上吹干。 h) 风干后加入 100 μL 灭菌的 TE 缓冲液溶解沉淀。 7.3 DNA 浓度的检测和定量 用 TE 缓冲液配制l μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL 和 10 μg/mL 的λ-DNA 分子 量标准溶液，各取3 μL λ-DNA分子量标准溶液和3 μL 步骤7.2中提取的未知浓度DNA溶液，在1%琼脂 糖凝胶上电泳15 min~20 min，稳压90 V，电泳缓冲液为1×TBE，325 nm紫外灯下观察，照相，检测提 取DNA的质量。按照GB/T 28660要求的方法，计算提取DNA溶液的浓度。 7.4 PCR 反应 7.4.1 PCR 反应体系 2 DB21/T 3429—2021 2+ 在4℃条件下进行操作。15 μL反应总体系中，含有10×PCR缓冲液1.5 mmol/L，Mg 1.5 mmol/L， dNTPs 0.3 mmol/L，正向、反向引物各 0.4 μmol/L，Taq DNA聚合酶 0.75 U，模板DNA 50 ng/μL。 7.4.2 PCR 反应程序 扩增程序首先94 ℃预变性5 min；随后的35个循环为：94℃变性30 s，复性30 s(不同SSR引物所需 的退火温度见附录C)，72℃延伸30 s；最后72℃延伸8 min，4℃保存。 7.4.3 PCR 产物的处理 PCR扩增反应结束后，在15 μL的反应体系中加入5 μL的上样缓冲液，充分混匀后，备用。 7.5 PCR 产物检测 7.5.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测 7.5.1.1 玻璃板的清洗 用洗涤剂清洗玻璃板（长板和短板），自来水冲洗干净，随后将玻璃板用蒸馏水冲洗2次，再用无 屑纸巾沾取无水乙醇擦拭2遍，置于通风橱内垂直晾干待用。 7.5.1.2 胶槽装配 a) 玻璃板的固定 将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭干净后置于长板玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地 压盖住，确认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封胶框中并用夹子固定在制胶板上。 b) 封胶 配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免出现 气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注，放置于温室下待其凝固后再进行下一步操作。 7.5.1.3 丙烯酰胺胶的配制 在30 mL 8%聚丙烯酰胺贮备液中加入100 μL 10%过硫酸铵和200 μL四甲基乙二胺，迅速轻轻混 匀。 7.5.1.4 灌胶 按照LY/T 2756要求的方法进行灌胶。灌胶后，将梳子轻轻插入灌胶口中，室温凝固30 min。 7.5.1.5 上样和电泳 待凝胶完全凝固后，将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下，灌胶口向内用夹子固定在电泳槽 上，使用1×TBE缓冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。垂 直缓慢将梳子从灌胶口中拔出，并用1×TBE缓冲溶液清洗和整理样品槽。使用200 μL移液器从左至右 逐个对点样孔进行吹打，直至点样孔内无碎胶、气泡以及其他杂质。取5 μL步骤7.4.3处理后的PCR扩 增产物上样，并在胶板的一侧或适当位置的点样孔中加入4 μL的DNA Marker (DL2000 Marker)作为对 照，电泳在200 V稳压，电流100 mA条件下进行，电泳时间约为1.5 ~2 h。 7.5.1.6 卸胶 3 DB21/T 3429—2021 电泳结束，关闭电源，将上槽中1×TBE缓冲液放出，取下固定的夹子，去掉下部琼脂糖，取下玻 璃板。将玻璃板水平放置，用起胶铲沿灌胶口一侧边缘将玻璃板缓慢撬起，将紧贴有凝胶的玻璃板放 入装有双蒸水的洗胶盘中轻轻摇晃，待凝胶与玻璃板完全分离后，取出玻璃板，放净双蒸水。 7.5.1.7