ICS 13.100 C 60 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 4007—2021 肿瘤高通量基因测序技术规范 Technical regulation of next-generation gene sequencing for tumors 2021 - 03 - 04 发布 江苏省市场监督管理局 2021 - 04- 04 实施 发 布 DB32/T 4007-2021 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 适用人群、指标要求及条件 ........................................................... 2 5 测序流程 ........................................................................... 3 6 质量评价 ........................................................................... 8 I DB32/T 4007-2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020规则起草。 本文件由江苏省卫生健康委员会提出。 本文件由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本文件主要起草单位：江苏省肿瘤医院、江苏吉诺思美精准医学科技有限公司、南京世和基因生物 技术有限公司、华大生物科技有限公司。 本文件主要起草人：冯继锋、吴建中、井昶雯、马蓉、曹海霞、王卓、刘思文、陈丹、张君莹、吴 旸、张圆。 II DB32/T 4007-2021 肿瘤高通量基因测序技术规范 1 范围 本文件规定了肿瘤高通量基因测序适用人群、指标要求及条件、测序流程、肿瘤高通道基因测序实 验室质量评价。 本文件适用于肿瘤患者的高通量基因测序检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 30989 高通量基因测序技术规程 医疗机构临床基因扩增管理办法 卫办医政发〔2010〕194号 医疗器械监督管理条例 国务院令第276号 医疗器械注册管理办法 国家食品药品监管总局令第4号 ISO 15189 医学实验室质量和能力的专用要求 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1 高通量基因测序 next-generation gene sequencing；NGS 区别于传统的双脱氧法测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，通过一次测 序反应能产出不低于100Mb的测序数据。 3.2 文库 library 通过生物来源的、人工合成的或者克隆技术等所得到的一个重建分子群，如基因组文库、互补文库、 噬菌体展示肽文库等。 3.3 测序通量 throughput of gene sequencing 单次测序可获得序列信息的基因片段数量或可测定的脱氧核糖核酸和核糖核酸（以碱基表示）的数 量。 1 DB32/T 4007-2021 3.4 有效通量 valid throughput 单次测序质量合格的基因片段数或碱基数。 3.5 测序准确率 accuracy of gene sequencing 对已知序列的基因进行测序，计算正确的碱基数占可识别的碱基数比例。 3.6 测序深度 depth of sequencing 待测样本中某个指定的核苷酸被检测的次数。 3.7 碱基识别质量 quality of base calling 测序过程中从荧光信号或者其他信号转换成序列，衡量碱基正确识别的概率。通常以数字值直接表 示。 4 适用人群、指标要求及条件 4.1 适用人群 能获取肿瘤细胞的肿瘤患者。 4.2 测序设备使用条件 4.2.1 环境温度：（18±5）℃，24 小时温度变化不超过 2 ℃，目标温度以各个仪器设备性能参数中的 要求而定。 4.2.2 环境湿度：根据以各个仪器设备性能参数中的要求而定。 4.2.3 工作电压：220 V。 4.2.4 电源保护：带有不间断 1500 W 电源器。 4.2.5 支撑平台：气压式缓冲系统的防震平台，防震效果达到 1 Hz 级别。 4.3 实验室要求 4.3.1 资质要求 开展肿瘤高通量测序医疗机构应该具备国家级卫生计生行政部门审批许可，并具备省级技术审核的 临床基因扩增实验室资质，相关工作开展符合《医疗机构临床基因扩增管理办法》的规定。 4.3.2 设置要求 4.3.2.1 参照 GB/T 30989 中规范性目录 B 的要求。实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有 操作符合 GB 19489 中的要求。 2 DB32/T 4007-2021 4.3.2.2 区域分区可分为：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、文库制备区、杂交捕获区 ／多重 PCR 区域（第一扩增区）、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测与质控区、测序区、数据存 贮区。 4.3.2.3 工作区空气及人员流向需严格按照《医疗机构临床基因扩增管理办法》配置。分区可根据实际 情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本与组织样本分开。 4.4 设备试剂要求 4.4.1 设备包括：高通量基因测序仪、DNA 提取相关设备、PCR 仪等，设备的种类、数量与试剂开 展的项目与检测标本的数量相匹配。 4.4.2 检测实验室应该做好仪器设备维护及保养，建立仪器设备标签管理、档案管理，按设备要求定 期进行计量校准及维护管理。 4.4.3 开展高通量基因测序的诊断机构和医院需严格按照《医疗器械监督管理条例》和《医疗器械注 册管理办法》使用国家食品药品管理总局（CFDA）获批注册的设备和试剂开展高通量基因测序工作。 4.4.4 涉及实验室自配试剂（LDT），需有严格的试剂制备标准操作规程（SOP），需经过临床实验 室自建项目验证合格才可使用。LDT 基于不同样本类型的性能验证的指标包括:精密度（批内、批间）、 准确度、分析灵敏度、分析特异性、可测量范围、样本稳定性、试剂稳定性、携带污染、参考范围、临 床诊断灵敏度、临床诊断特异性。 4.5 检测项目管控 4.5.1 检测项目验证因素包括：建库方法、测序平台和分析工具以及不同的突变类型（包括单碱基突 变（single nucleotide variant，SNV）、小片段插入或者缺失（ins，del）、基因拷贝数变异（copy number variations，CNV）、染色体结构变异（structural variation，SV））以及不同的样本类型（如 FFPE 组织、 新鲜组织、全血、胸水等）。 4.5.2 验证参数包括：目标区域测序（panel）的准确性、精确性、敏感性、特异性。 4.6 人员要求 4.6.1 高通量测序检测技术人员需具备临床病理学、分子生物学的相关专业大专以上学历，需接受省 级卫生计生行政部门组织的高通量基因测序技术培训，或者省级卫生计生行政部门颁发的培训合格证 书；需具有临检中心《临床基因扩增实验室技术人员培训合格证》。 4.6.2 数据分析人员需具有临床医学、分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。 4.6.3 实验室需依照《医学实验室质量和能力的专用要求》（ISO 15189）进行内部人员周期性培训和 考核机制并制定文件化程序，保留相关记录。 5 测序流程 5.1 测序前准备 5.1.1 医师须自觉维护患者的权利，尊重患者的知情同意权和选择权，保护患者隐私。 5.1.2 全面客观宣教高通量测序在肿瘤中的应用价值，优缺点及可供选择的高通量测序方案等。 5.1.3 告知要点主要包括： a) 检出率、假阳性率。 b) 该检测有失败的风险，可能会重新检测，检测周期变长。 3 DB32/T 4007-2021 c) 告知该检测的局限性。 d) 检测的种类、费用和技术流程。 5.2 标本采集 5.2.1 样本类型 5.2.1.1 新鲜组织 在显微镜下确认肿瘤细胞所占比例应≥ 30 %，坏死细胞所占比例应≤ 10 %，相关的病理检测结果 保存备查。样本采集后立即放入液氮完全冷冻，-80 ℃低温保存，干冰运输。 5.2.1.2 石蜡组织/切片组织 10 %中性福尔马林固定手术标本，按病理学操作规范进行取材。5 ～ 10张石蜡包埋标本切片，厚 度为5 μm ～ 10 μm，用载玻片片盒或者离心管保存，常温保存、运输。其中一片进行HE染色，确认肿 瘤细胞含量。活检材料的固定时间一般是24小时以内。 5.2.1.3 体液 体液中的肿瘤细胞用于基因检测时，需确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给细胞病理检查之 后，剩余液体冷藏/冷冻保存，或在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液室温保 存。 5.2.1.4 外周血 采集外周血提取血浆游离DNA进行检测，取样时需使用一次性密闭EDTA抗凝真空采血管，采集 6ml～10ml全血，冷藏运输，6小时内分离血浆，提取游离DNA，保存到-80 ℃冰箱中，并避免反复冻融。 如外周血需长时间运输，建议用商品化的游离DNA样本保存管，在常温条件下，cfDNA在全血中可稳 定保存7天。 5.2.2 采样质量评价 5.2.2.1 评价内容 细胞组成、肿瘤细胞的数量，是否按照要求进行处理与运输。 5.2.2.2 评价方法 5.2.2.1.1 包括肉眼观察、显微镜下观察和浓度分析等。 5.2.2.1.2 需经病理医师审阅，取一张切片 HE 染色后显微镜下观察，确保肿瘤细胞存在，并记录肿 瘤组织含量，标注肿瘤细胞密集区域。肿瘤细胞比例在 20 %以上。 5.2.3 样本采集中的防污染 5.2.3.1 5.2.3.2 5.2.3.3 5.2.3.4 5.2.3.5 样本采集需采用一次性材料。 采集中需注意防止污染，防止混入操