(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210568493.3 (22)申请日 2022.05.24 (71)申请人 天津大学 地址 300350 天津市海河教育园区雅观路 135号天津大 学北洋园校区54楼-213 (72)发明人 元英进　史一婷　肖文海　董天宇　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 温可睿 (51)Int.Cl. C12N 15/60(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/31(2006.01)C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12P 7/62(2022.01) C12P 17/18(2006.01) C12P 7/40(2006.01) C12P 5/00(2006.01) A61K 31/365(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 生产小白菊内酯的重组酿酒酵母菌株及其 构建方法 (57)摘要 本发明涉及微生物基因工程领域， 尤其涉及 生产小白菊内酯的重组酿酒酵母菌株及其构建 方法。 本发 明提供了一种生产小白菊内酯的重组 酿酒酵母菌株及其构建方法， 以一株高产FPP的 重组酿酒酵母为底盘菌株， 将四个外源基因GAS、 GAO、 COS、 P TS， 逐个整 合到底盘菌株中， 得到生产 吉玛烯A、 吉玛酸、 木香烃内酯、 小白菊内酯的菌 株。 并筛选不同来源的酶。 通过分别过表达ZWF1 和POS5△17来增加NADPH的供应， 筛选效果最好 的改造。 路径酶的定位， 尤其是P450酶定位于内 质网后， 通过分别过表达INO2和HAC1， 分别敲除 OPI1、 PAH1来扩展内质网的面积， 筛选效果最好 的改造， 从而大 大增加小白菊内酯的产量。 权利要求书1页 说明书12页 序列表15页 附图6页 CN 114774443 A 2022.07.22 CN 114774443 A 1.基因组合， 其包括GAS、 GAO、 COS和PTS中至少两种。 2.根据权利要求1所述的基因组合， 其特征在于， 还包括ZWF1、 POS5 △17、 INO2或HAC1截 短体中的至少一种。 3.表达载体， 其包括骨架载体和权利要求1或2所述的基因 组合。 4.转化或转染权利要求权利3所述表达载体的宿主。 5.根据权利 要求4所述的宿主， 其特征在于， 其为含有倍半萜的合成前体， 且表达CPR1、 CYB5、 ADH1和ALDH1的酿酒酵母菌 。 6.根据权利要求4或5所述的宿主， 其特征在于， 其表达GAS、 GA O、 COS、 PTS、 ZWF1、 POS5 △ 17、 INO2和HAC1； 且其OPI1和PAH1基因被敲除。 7.权利要求4～6任一项宿主的构建方法， 其特征在于， 所述构建方法包括如下一种或 几种改造： 1)转入GAS、 GAO、 COS、 PTS基因中的一种或几种； 2)将酵母底盘菌株的ZWF1和/或POS5过表达； 3)过表达I NO2和/或HAC1截短体； 4))敲除OPI1和/或PAH1。 8.吉玛烯A、 吉玛酸、 木香烃内酯和/或小白菊内酯的制备方法， 其特征在于， 包括培养 权利要求4～6任一项 所述的宿主， 获得含有所述吉玛烯A、 吉玛酸、 木香烃内酯和/或小白菊 内酯的培 养物； 或包括将权利要求7所述的构建方法得到的酵母基因工程菌株进行发酵培养， 获得含 有所述吉玛烯 A、 吉玛酸、 木香烃内酯和/或小白菊内酯的培 养物。 9.权利要求1～2任一项所述的基因组合、 权利要求3所述的表达载体、 权利要求4～6任 一项所述的宿主、 权利要求7所述构建方法制得的宿主、 权利要求8所述制备方法制得的小 白菊内酯， 和/或权利要求8所述制备 方法制得的培 养物在制备防治癌症药物中的应用。 10.一种防治癌症的药物， 其包括权利要求8所述制备方法制得的小白菊 内酯， 和/或权 利要求8所述制备方法制得的含有所述小白菊内酯的培养物； 所述癌症包括骨髓瘤、 直肠 癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 前列腺癌和/或白血病。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774443 A 2生产小白菊内酯的重组酿酒酵母 菌株及其构建 方法 技术领域 [0001]本发明涉及 微生物基因工程领域， 尤其涉及生产小白菊内酯的重组酿酒酵母菌株 及其构建方法。 背景技术 [0002]小白菊内酯(Parthenolide)是一种倍半萜内酯， 来源于植物小白菊(Tanacetum   parthenium)。 其亚甲基γ ‑内酯环和环氧基团的亲核性质使其能强效抑制核因子κB (Nuclear  factor kB,NF‑κB)、 组蛋白去乙酰化酶和白细胞介素 ‑12的活性， 可以抑制许多 类型癌症， 如骨髓瘤、 直肠癌、 乳腺癌、 宫颈癌和前列腺癌， 并且小白菊内酯是首个被发现可 以选择性地消灭急性骨髓白血病干细胞的小分子化合物。 然而， 由于小白菊内酯水溶性低、 稳定性差， 它不能达到与其给药剂量相当的效果。 ACT001是小白菊内酯的衍生物， 口服后可 迅速分布到各组织， 并可通过血脑屏障扩散， 它 是急性骨髓白血病细胞和脑胶质瘤细胞 的 有效抑制剂， 目前正在进 行二期临床试验。 小白菊内酯主要的来源是从植物中提取但是， 小 白菊内酯在植物 中的含量不高， 在干燥的小白菊叶子中的含量是0.14％～0.74％， 在山玉 兰根皮中含量是3.1％～8.0％。 而且植物种植需要很大的占地面积， 并且周期较长。 化学全 合成主要是从C10化合物出发， 反应步骤多得率低而且还要考虑立体异构性等问题。 所以， 目前小白菊内酯的获得是不可持续的， 无法满足日益增长的市场需求。 随着合成生物学 的 发展以及更多的基因被发现， 微生物细胞工厂是一个很值得开发的方向来生产小白菊内 酯。 [0003]小白菊内酯生物合成的内源路径为MVA路径， 外源路径从法尼基二磷酸(FPP)出 发， 第一步经过吉玛烯A合成酶(GAS)将FPP环化为吉玛烯A， 形成10元碳环的骨架。 近年来， 已从菊苣、 莴苣、 向日葵等植物中发现了不同的GAS。 第二步经过细胞色素P450酶(P450酶)， 首先是吉玛烯A氧化 酶(GAO)将吉玛烯A的C12甲基经过三步氧化为吉玛酸， 已从几种菊科植 物中分离出来GAO。 下一步的催化 酶是木香烃内酯合 成酶(COS)， 其将吉玛酸的C6羟基化， 然 后C6羟基和C12 羧基自发形成内酯环， 生 成木香烃内酯。 最后一步是小白菊来源的小白菊内 酯合成酶(PTS)催化木香烃内酯C4 ‑C5双键的环氧化作用， 合成小白菊内酯。 [0004]小白菊内酯生物合成的难点主要在GAO、 COS、 PTS这三个P450酶的连续催化。 由于 工程化P450酶被认为是一个主要的挑战， 在异源微生物中串联操纵多达三个P450酶， 显然 将是小白菊内酯生物合成的主要障碍。 到目前为止， 在微生物中从头开始生物合成小白菊 内酯还没有被充分研究。 因为亟待需要相关研究构建能从头开始生物合成， 并且可以酶连 续的并高产小白菊内酯的菌株。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供一种生产小白菊内酯的重组酿酒酵 母菌株及其构建方法。 [0006]本发明提供了基因 组合， 其包括GAS、 GAO、 COS和PTS中至少两种。说　明　书 1/12 页 3 CN 114774443 A 3