(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210579334.3 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 余日胜　杨晓艳　杜永忠　卢园飞　 周巧妹　余洁倪　王晓洁　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 郑海峰 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2020.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 47/42(2017.01)A61K 47/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼及 其制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种胶原酶功能化的仿生载 药金纳米笼及其制备方法和应用。 以银纳米粒为 模板通过Galvanic置 换反应合成金纳米 笼， 通过 静电吸附作用， 有效负载化疗药物阿霉素， 提取 胰腺癌肿瘤细胞膜， 再将细胞膜包覆于载药金纳 米笼表面， 利用脂质插入法将胶原酶偶联于肿瘤 细胞膜上， 得到胶原酶功能化的细胞膜包覆的载 药金纳米笼。 该仿生功能化金纳米笼通过肿瘤细 胞膜的同源靶向性， 高效靶向至胰腺癌肿瘤组织 部位， 在从细胞外间质渗透进入肿瘤细胞的过程 中， 通过胶原酶逐步水解胰腺癌肿瘤组织中致密 的细胞外基质， 使载药纳米笼有效渗透进入肿瘤 组织， 肿瘤细胞摄取后， 在近红外激光的照射下， 发挥光热、 光动力、 化疗联合治 疗效应。 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 CN 114949213 A 2022.08.30 CN 114949213 A 1.一种胶原酶功能化的仿生载 药金纳米笼的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)将盐酸阿霉素和金纳米笼溶于水中， 混合后置于室温下搅拌， 搅拌后离心收集， 得 到载药金纳米笼 溶液； (2)BxPC3细胞膜的提取 BxPC3细胞在液氮和37℃下反复冻融细胞， 充分裂解细 胞； 离心沉淀未破碎细 胞与细胞 核， 收集上清， 将上清离心， 收集 沉淀即为 提取的细胞膜。 (3)胶原酶的偶联及 细胞膜包覆 称取Traut试剂溶于pH＝8的PBS溶液中， 称取胶原酶溶于PBS中， 将Traut溶液与胶原酶 溶液混合后于室温下置于摇床中， 震荡反应， 得到巯基化胶原酶； 将DSPE ‑PEG‑MAL溶于pH＝ 6.5的PBS溶液中， 取巯基化胶原酶逐滴加入其中， 室温下置于摇床中震荡反后得到DSPE ‑ PEG‑胶原酶； 取步骤(2)所得的细胞膜加入到载药金纳米笼溶液中， 室温下置于超声波细胞粉碎机 超声处理， 得到细胞膜包覆的金纳米笼， 取DSPE ‑PEG‑胶原酶加入到包覆细胞膜后的金纳米 笼溶液中， 室温下孵育， 以允许DSPE ‑PEG‑胶原酶通过脂质融合插入到细胞膜 中， 得到胶原 酶功能化的仿生载 药金纳米笼。 2.根据权利要求1所述的胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 盐酸阿霉素与金纳米笼的质量比为0.15 ‑0.3： 1； 室温下搅拌的时间为24 ‑48h。 3.根据权利要求1所述的胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中， Traut试剂与胶原酶 的质量比为0.5 ‑1:1； Traut溶液与胶原酶溶液混合后的震 荡反应条件为： 100 ‑120rpm震荡反应1 ‑2小时； 震荡反应后用3kd超滤管离心除去过量的 Traut试剂。 4.根据权利要求1所述的胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 细胞膜与金纳米笼 溶液中的金纳米笼的质量比为0.8 ‑1.6： 1。 5.根据权利要求1所述的胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中， DSPE ‑PEG‑胶原酶与金纳米笼溶液中的金纳米笼的质量比为0.5 ‑1： 1， 加入 DSPE‑PEG‑胶原酶后， 室温下孵 育1‑4小时。 6.一种权利要求1 ‑5任一项所述方法制备 得到的胶原酶功能化的仿生载 药金纳米笼。 7.根据权利要求6所述的胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼， 其特征在于， 其特征在 于， 中空多孔金纳米笼内负载化疗药物盐酸阿霉素， 表面包覆由胶原酶功能化的胰腺癌肿 瘤细胞膜， 组成胶原酶功能化的仿生载 药金纳米笼。 8.根据权利要求6所述的胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼， 其特征在于， 所述胶原酶 功能化的仿生载药金纳米笼， 其组成成分包括金纳米笼、 盐酸阿霉素、 胰腺肿瘤细胞膜、 胶 原酶磷脂偶联物， 其质量百分比为金纳米笼29.41％ ‑40.82％； 盐酸阿霉素6.12％ ‑ 11.54％； 胰腺肿瘤 细胞膜25.81％‑47.06％； 胶原酶磷脂偶联物14.71％ ‑32.26％。 9.根据权利要求6所述的胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼， 其特征在于， 所述的胶原 酶磷脂偶联物(DSPE ‑PEG‑胶原酶)由巯基化胶原酶与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇 2000‑马来酰亚胺(DSPE‑PEG‑MAL)组成。 10.权利要求6所述的胶原酶功能化的仿生载药金纳米笼在制备胰腺癌治疗药物中的 应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114949213 A 2一种胶原酶功能化的仿生载药 金纳米笼及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属纳 米给药系统的制备， 具体涉及胶原酶功能化的仿生载药金纳 米笼和制 备方法， 以及 胶原酶功能化的仿生载 药金纳米笼在胰腺癌治疗中的应用。 背景技术 [0002]胰腺癌是一种高度侵袭性的恶性肿瘤， 5年生存率仅为9％， 是预后最差的恶性肿 瘤之一。 由于缺乏明显的早期症状， 多 数患者在就诊时已发展成 中晚期阶段， 高达8 5％的胰 腺癌患者的肿瘤无法通过手术切除， 多数患者依靠全身化疗进行治疗。 全身化疗是目前晚 期胰腺癌的一线治疗方式， 但这些患者的预后仍然很差， 胰腺癌不仅对化疗具有抵抗性， 对 靶向治疗以及免疫治疗都具有明显的抵抗性。 其治疗上的困难和极差的预后主要归因于其 肿瘤细胞的高度侵袭性以及其特殊肿瘤病理特征。 胰腺癌的病理特征是由不同细胞和细胞 外成分(例如胶原蛋白和透明质酸)组成的致密的纤维增生基质， 这种致密的基质产生固体 应力并增加间质液压力， 严重了阻碍药物的有效渗透， 使得药物难以渗透进入肿瘤组织发 挥作用。 [0003]纳米给药系统由于其增强的渗透滞留效应(EPR效应)， 能够增加 药物在肿瘤组织 中的渗透和积累， 有效改善治疗效应和 提高药物疗效， 已经在多种实体瘤中得到了广泛的 研究。 但这种效应在 胰腺癌肿瘤组织中难以实现， 由于其致密的细胞外基质， 限制了纳米给 药系统的EPR效应， 使得药物难以渗透进入肿瘤组织发挥疗效。 胶原蛋白是一种三螺旋蛋 白， 是胰腺癌细胞外基质中的主要结构成分。 胶原酶是一种水溶性蛋白酶， 能够特异性水解 胶原蛋白， 胶原酶在沿胶原 三螺旋的不同位点切割， 将其降解为 10‑95kDa的亚基。 胶原蛋白 的水解能够有效减轻肿瘤细胞外基质的间质压力， 使得药物 能够有效渗透进入肿瘤组织。 但其对胶原蛋白的水解缺乏组织特异性， 并且在非药物渗透途径上的水解可能会造成肿瘤 细胞的扩散， 因此， 特异性靶向胰腺癌肿瘤组织， 沿药物渗透途径降解胰腺癌细胞外基质， 才能使得 药物有效的发挥胰腺癌杀伤作用。 [0004]金纳米笼(AuNC)是一种中空、 多孔状的金属纳米结构， 因其优良的物理化学特性 在癌症诊断和治疗的潜力而引起了很大的关注。 金纳米笼的关键特征使其多样化的生物医 学应用成为可能， 其特殊的光学性质， 尤其是局部表面等离子体共振 特性， 能够在近红外光 的激发下产生光热效应和光动力效应， 通过高热和活性氧杀伤肿瘤细胞。 金纳米笼还可以 用作光声成像和CT成像的造影剂对疾病进 行诊断； 此外其中空、 多孔的结构， 使其可以做 为 药物载体有效的负载化疗药物， 但载药金纳米笼不能主动靶向肿瘤组织， 同时其装载的药 物也可能会提前发生 渗漏， 使得 药物在循环过程中损失减少。 [0005]细胞膜包被的纳米技术是将合成的纳米粒核心包被一层天然细胞膜， 多种细胞膜 包被的纳米粒固有地模仿了它们的膜来源细胞的特性， 赋予了纳米粒广泛的功能， 如长循 环和主动靶向性， 其中肿瘤细胞来源的细胞膜具有同源靶向性， 能够通过表面黏附分子靶 向其来源的肿瘤 细胞。说　明　书 1/9 页 3 CN 114949213 A 3