(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210577793.8 (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 全球细胞控股 （广州） 有限公司 地址 510095 广东省广州市越秀区环市中 路316号26 05室A200 (72)发明人 李久续　山口桥一郎　 (74)专利代理 机构 北京爱普纳杰 专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11419 专利代理师 何自刚 (51)Int.Cl. C12N 5/0784(2010.01) C12N 5/0783(2010.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型 免疫细胞制备方法 (57)摘要 一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型 免疫细胞制备方法,其特征在于， 包括如下步骤： 步骤1， 采集外周血并分离 出单个核细胞， 对分离 出的单个核细胞进行培养， 留取悬浮细胞和贴壁 细胞； 步骤2， 通过所述 贴壁细胞培养 出成熟DC细 胞； 步骤3， 通过所述悬浮细胞利用特定免疫细胞 基础培养液进行接种以培养出特定免疫细胞培 养体系； 步骤4， 向所述特定免疫细胞培养体系中 加入在所述 步骤2中获得的DC细胞进行共培 养。 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 CN 114657124 A 2022.06.24 CN 114657124 A 1.一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其特征在于， 包括如 下步骤： 步骤1， 采集外周血并分离出单个核细胞， 对分离出的单个核细胞进行培养， 留取悬浮 细胞和贴壁细胞； 步骤2， 通过 所述贴壁细胞培 养出成熟DC细胞； 步骤3， 通过所述悬浮细胞利用特定免疫细胞基础培养液进行接种以培养出特定免疫 细胞培养体系； 步骤4， 向所述特定免疫细胞培养体系中加入在所述步骤2中获得的DC细胞进行共培 养。 2.根据权利要求1所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其 特征在于， 所述特定免疫细胞选自γ δT细胞和NKT/NK细胞中的至少一个。 3.根据权利要求2所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其 特征在于， 所述 步骤3中还 包括如下步骤： 步骤301， 根据特定的免疫细胞加入相应的成分并置 于适宜环境下进行培 养； 步骤302， 在培养了第一预定时间后进行第一补液操作， 然后再培 养第二预定时间。 4.根据权利要求3所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其 特征在于， 当所述特定免疫细胞选择为γδT细胞时， 所述相应的成分包括唑来膦酸、 CD28、 Gardiquimod和白介2， 所述第一补液包括白介素因子IL2和自体血清； 当所述特定免疫细胞 选择为NKT/NK细胞时， 所述相应的成分包括重组黏连蛋白、 CD3、 CD161和透明质酸， 所述第 一补液包括白介素因子I L2和白介素I L7、 IL15、 IL18、 IL21。 5.根据权利要求4所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其 特征在于， 在步骤4中还 包括如下步骤： 步骤401， 在共培 养期间， 每间隔第三预定时间进行第二补液。 6.根据权利要求5所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其 特征在于， 所述第一预定时间为72 ‑96小时， 所述第二预定时间为5天， 第三预定时间为1 天。 7.根据权利要求6所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其 特征在于， 当所述特定免疫细胞选择为γδT细胞时所述第二补液包括： 白介素因子IL2； 当 所述特定免疫细胞选择为NKT/NK细胞时所述第二补液包括白介素因子IL2和白介素IL7、 IL15、 IL18、 IL21。 8.根据权利要求7对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其特征在 于， 所述步骤1中还 包括如下步骤： 步骤101， 在离心管滴加Lymphoprep人淋巴细胞分离液并在所述分离液上层沿着所述 管壁滴加全血同时避免血 液浸润至分离液 下层； 步骤102， 在室温条件下， 900g离心20分钟， 将上层 血浆吸附至另一个离心管中， 56℃灭 活， 零下20度冰箱静置10分钟， 再次离心后留取 上清； 步骤103， 用移液 管吸出中间的白膜层样细胞群， 置 于新的离心管中， 多次清洗 离心； 步骤104， 用无血清培养基重悬分离好的单个核细胞， 按照1X106/ml接种， 置于37℃培 养箱， 5%二氧化 碳环境下培 养。 9.根据权利要求8对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其特征在权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114657124 A 2于， 还包括步骤5， 收集细胞送检流式检测纯度、 细胞计数仪进行计数。 10.根据权利要求9对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法， 其特征在 于， 所述步骤2中使用基础培养基为551H3无血清培养液进 行培养； 步骤3中当所述特定免疫 细胞选择为γδT细胞时使用基础培养基为X ‑VIVO无血清培养液， 当所述特定免疫细胞选择 为NKT/NK细胞时使用基础培 养基为SCGM无 血清培养液。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114657124 A 3