(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210583135.X (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 西部医美生物科技成 都有限公司双 流医疗分公司 地址 610000 四川省成 都市双流区九江街 道千子门路3 33号6幢3层1号 (72)发明人 王显荣　李素芬　王亮　 (51)Int.Cl. C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/21(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 临床血液免疫细胞制剂的制备方法及其应 用 (57)摘要 本申请公开了一种临床血液免疫细胞制剂 的制备方法及其应用。 该制备方法， 通过分离表 达CD8和CD28的T细胞， 利用慢病毒介导， 将人源 KIR 3DS1受体和人源 IFN‑α1转入该T细胞， 得到 了稳定表达KIR3DS1受体和IFN ‑α1的T细胞系。 该T细胞系不仅能够于体外杀伤多种肿瘤细胞， 还与体内具有减缓肿瘤生长、 提升生存率的治疗 效果， 而且副反应小， 具有广泛的开发前 景。 权利要求书2页 说明书11页 序列表10页 附图3页 CN 115058455 A 2022.09.16 CN 115058455 A 1.一种临床血 液免疫细胞制剂的制备 方法， 包括： 获得分离的表达 CD8和CD28的T细胞； 制备携带人源KIR  3DS1受体转录本和人源IFN ‑α1转录本的慢病毒， 其中， 人源KIR   3DS1受体转录本的核苷酸序列如NCBINM_001368254.1所示， 人源IFN ‑α 1转录本的核苷酸序 列如NCBI NM_024013.3所示； 将慢病毒侵染细胞， 获得表达KIR  3DS1受体和IFN ‑α 1的T细胞， 将该T细胞溶解或分散 在适于其 生长的电解质溶 液中， 以制得临床血 液免疫细胞制剂。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， “制备携带人源KIR  3DS1受体转录本和人源 IFN‑α 1转录本的慢病毒 ”包括： 合成得到人源KIR  3DS1受体转录本和人源IFN ‑α 1转录本的核苷酸序列， 以作为目的片 段； 将所述目的片段 连接进入载体， 并进行慢病毒包 装， 制得重组慢病毒载体。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其中， 所述目的片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1 或2所示。 4.根据权利要求2所述的制备方法， 其中， 在合成得到所述目的片段后， 所述制备方法 还包括对所述目的片段进行扩增的步骤， “对所述目的片段进行扩增的步骤 ”具体包括： 设计第一引物对 对所述目的片段第1～ 960bp区域进行扩增； 设计第二引物对 对所述目的片段第940bp～190 0bp区域进行扩增； 设计第三引物对 对所述目的片段第1890bp →3’端区域进行扩增； 以及 将扩增得到的所述第1～960bp区域、 所述第1～960bp区域和所述第1890bp →3’端区域 经过酶切后纯化， 混合作为模板， 再次利用第一引物对、 第二引物对和第三引物对的混合引 物进行PCR扩增的步骤。 5.根据权利要求2所述的制备 方法， 其中， “进行慢病毒包 装”的步骤包括： 将测序正确的携带所述目的片段的重组质粒接种至含抗生素的LB培养基中充分培养 后， 提取菌液， 裂解， 纯化， 提取和收获重组质粒； 以及 将所述重组质粒转入2 93T细胞中， 收获包 装好的慢病毒上清液。 6.根据权利要求5所述的制备方法， 其中， “分离临床血液来源的表达CD8和CD28的T细 胞”的步骤包括： 提取受孕的雌性CBA/J孕鼠的脾脏细胞； 利用免疫应该抗体标记和磁珠对其进行分选， 得到表达 CD8和CD28的T细胞。 7.根据权利要求6所述的制备 方法， 其中， “将慢病毒侵染细胞 ”的步骤包括： 将分选得到的表达CD8和CD28的T细 胞与慢病毒上清液混合， 于37℃培养10h后， 去除慢 病毒上清液， 更换新鲜的α ‑MEM培养基， 继续培养， 侵染培养养5天后， 即获得表达KIR  3DS1 受体和IFN ‑α 1的T细胞。 8.一种临床血液免疫细 胞制剂， 其包含稳定表达KIR  3DS1受体和IFN ‑α 的T细胞， 所述T 细胞还表达 CD8和CD28。 9.根据权利要求9所述的临床液免疫细胞制剂， 还 包含在适于其 生长的电解质溶 液。 10.权利要求1～7任一所述的制备方法制得的临床液免疫细胞制剂、 权利要求8或9所 述的临床液免疫细胞制剂在制备抗肝癌、 慢性髓原白血病、 乳腺癌和结肠癌相关药物和制权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115058455 A 2剂中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115058455 A 3