(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210588273.7 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 中国科学院长春应用化学研究所 地址 130022 吉林省长 春市人民大街5 625 号 (72)发明人 陈杰　田华雨　刘圣洋　吴嘉言　 冯元吉　郭兆培　陈学思　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 张柳 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 39/39(2006.01)A61K 9/51(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 31/136(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 细胞膜、 纳米疫苗及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及生物医疗领域， 尤其涉及细胞 膜、 纳米疫苗及其制备方法和应用。 本发明提供 了细胞膜， 上述细胞膜不包括CD47信号 分子和包 括CRT信号分子。 本发明提供的一种双生物工程 化细胞膜包裹纳米疫苗能够有效担载抗原和佐 剂、 促进抗原提呈细胞的内吞和活化， 最终实现 高效特异性抗肿瘤免疫响应， 在肿瘤临床治疗领 域具有广泛的应用前 景。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 CN 114807229 A 2022.07.29 CN 114807229 A 1.细胞膜， 其特 征在于， 所述细胞膜不包括CD47信号分子和包括CRT信号分子 。 2.如权利要求1所述细胞膜的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1： 取CD47基因敲除质粒转染肿瘤 细胞， 细胞分选后， 获得CD47敲除肿瘤 细胞系； S2： 取所述CD47敲除肿瘤 细胞系与化疗药物混合， 获得细胞； S3： 提取所述细胞的细胞膜， 获得 所述细胞膜。 3.纳米疫苗， 其特征在于， 所述纳米疫苗包括如权利要求1所述细胞膜和/或如权利要 求2所述制备 方法制得的细胞膜， 和纳米佐剂； 所述纳米佐剂包括： 阳离 子载体和核酸佐剂。 4.如权利要求3所述的纳米疫苗， 其特征在于， 所述细胞膜与 所述纳米佐剂的质量比为 1： (1～10)。 5.如权利要求3或4所述的纳米疫苗， 其特征在于， 所述阳离子载体包括聚乙烯亚胺、 壳 聚糖或聚β 氨脂中的一种或多种； 所述核酸佐剂包括寡脱氧核苷酸和/或环鸟甘酸 ‑腺苷酸。 6.如权利要求3 至5任一项所述纳米疫苗的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1： 取CD47基因敲除质粒转染肿瘤 细胞， 细胞分选后， 获得CD47敲除肿瘤 细胞系； S2： 取所述CD47敲除肿瘤 细胞系与化疗药物混合， 获得细胞； S3： 提取所述细胞的细胞膜， 获得 所述细胞膜； S4： 取所述阳离 子载体和所述核酸佐剂混合， 获得 所述纳米佐剂； S5： 取所述细胞膜与所述纳米佐剂混合， 获得 所述纳米疫苗。 7.如权利要求2或6所述的制备 方法， 其特 征在于， S1中所述 转染的时间为 40～50h。 8.如权利要求2、 6或7所述的制备方法， 其特征在于， S2中所述化疗药物包括蒽环类药 物， 所述化疗药物的终浓度为2 ～4 μM。 9.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， S4中所述阳离子载体与所述核酸佐剂的 质量比为1： (1～3)。 10.如权利要求1所述细胞膜和/或如权利要求2所述制备方法制得的细胞膜、 如权利要 求3至5任一项 所述纳米疫苗和/或如权利要求6至9任一项 所述制备方法制得的纳米疫苗在 制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807229 A 2细胞膜、 纳米疫苗及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物医疗领域， 尤其涉及 细胞膜、 纳米疫苗及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]肿瘤疫苗通过诱导抗肿瘤特异性免疫反应， 促进免疫系统识别和清除肿瘤细胞， 在临床实 践中取得了良好的进 展。 [0003]近年来， 科学家筛选出了许多肿瘤特异 性抗原(tumor ‑specific  antigens,TSAs) 并组装在肿瘤 疫苗中。 然而， 由于个体间肿瘤抗原表位的多样性， 个体化疫苗表现出独特的 优势。 此外， 肿瘤细胞的突变率往往较高， 这可能导致一个或多个抗原 位点的丢失， 因此， 设 计直接针对多表位的疫苗是具有潜在前景。 患者自体肿瘤全细胞抗原提供了独特 的优势， 避免了复杂抗原筛选和制造过程的时间滞后问题， 能够诱导抗原提呈细胞加工和呈递大量 的肿瘤抗原， 刺激强大的多克隆T细胞响应， 防止肿瘤免疫逃逸。 [0004]全肿瘤细胞膜拥有完整的细胞膜蛋白抗原， 能够产生针对多种肿瘤抗原的抗肿瘤 免疫应答。 然而， 肿瘤细胞通过高表达免疫抑制分子来下调其免疫原 性， 从而能够逃避免疫 监视。 导致提取的肿瘤细胞膜表面抗原不能被抗原提呈细胞(antigen ‑presenting  cell, APCs)有效识别和内吞， 最 终难以有效地呈现给T细胞。 因此， 提高APC s对疫苗的识别和吞噬 能力是研制有效肿瘤疫苗的关键。 CD47是一种在多种肿瘤细胞表面过表达的跨膜蛋白， 它 可以与髓系细胞中的信号调节蛋白α(SIRPα )结合， 发出 “别吃我”信号， 避免被免疫系统清 除。 阻断该通路可促进APCs对肿 瘤细胞的摄取， 有利于肿瘤抗原的呈递。 最近， 制药公司开 发了抑制CD47 ‑SIRPα 免疫检查点通路的抗体。 然而， 根据临床资料， CD47抗体仍可能引起全 身性的副作用， 包括红细胞的积累或清除。 因此， 需要一种更安全、 更有效的阻断CD47的方 法来提高肿瘤相关抗原的免疫原性。 [0005]另外， 仅仅阻断该信号并不能有效促进免疫系统识别膜表面的多种抗原。 主要原 因是抗原提呈细胞也需要一个 “吃我”的信号来进行吞噬。 临床前研究发现， 蒽环类或紫杉 类化疗药物不仅能发挥其原有的抗肿瘤作用， 还能通过诱导免疫原性细胞死亡 (immunogenic  cell death,ICD)来释放大量免疫刺激信号。 这些信号可促进肿瘤相关抗原 被吞噬细胞内吞， 刺激宿主产生抗肿 瘤免疫应答。 ICD典型的生化特征是钙 网蛋白(CRT)的 细胞膜易位、 高迁移率组蛋白1(HMGB 1)和三磷酸腺苷(ATP)的释放。 尤其值得注意的是， 易 位的CRT可与DC s表面的受体相互作用， 发出 “吃我”信号， 促进抗原吞噬， 从而激活自然免疫 和适应性免疫。 然而， 应用蒽环类或紫杉醇类化疗药物在临床实践中并未产生持久的免疫 反应。 不可忽视的问题是化疗诱导的ICD伴随着大量ATP的释放， 这些ATP被外切酶进一步代 谢为腺苷(ADO)。 ADO是一种免疫抑制代谢产物， 可与免疫细胞表 面的ADO 2A受体结合， 限制 细胞毒性淋巴细胞的激活， 抑制自然杀伤细胞的成熟， 从而损害抗肿瘤免疫反应。 此外， 在 肿瘤细胞ICD晚期， 细胞破裂并释放钾离子到细胞外间隙。 在正常情况下， 钾离子在细胞内 浓度较高， 而不是在细胞外。 钾离子水平的升高可降低T细胞的活性和抗肿瘤作用。 因此， 如 何利用ICD效应产生免疫促进信号， 同时避免一系列免疫抑制信号成为 一个挑战。说　明　书 1/8 页 3 CN 114807229 A 3