(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210584556.4 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 深圳市人民医院 地址 518000 广东省深圳市罗湖区翠竹街 道东门北路1017号大院 (72)发明人 王琦　王继刚　徐小龙　丁有斌　 杨传彬　李洁璇　 (74)专利代理 机构 深圳壹舟知识产权代理事务 所(普通合伙) 44331 专利代理师 欧志明 (51)Int.Cl. C07K 16/18(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/70(2006.01) A61K 47/68(2017.01)A61K 49/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与 应用 (57)摘要 本发明实施例公开了一种血清白蛋白结合 纳米抗体及其制备方法与应用， 其中， 血清白蛋 白结合纳米抗体包括纳米抗体Nb8， 其氨基酸序 列如Seq.ID  No.1所示， 纳米抗体Nb8不仅对牛血 清白蛋白具有较高的亲和力， 同时对小鼠血清白 蛋白和人血清白蛋白均有较好的结合活性， 具有 较好的广谱使用范围， 能够 有效应用于制备增强 药物半衰期的药物中以及制备肿瘤细胞成像的 试剂中。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 115028719 A 2022.09.09 CN 115028719 A 1. 一种血清白蛋白结合纳米抗体， 其特征在于， 所述血清白蛋白结合纳米抗体包括纳 米抗体Nb8， 且， 所述纳米抗体Nb8的氨基酸序列如Seq.ID  No.1所示。 2. 根据权利要求1所述的血清白蛋白结合纳米抗体， 其特征在于， 所述纳米抗体Nb8包 括4个框架区FR1、 FR2、 FR3、 FR4和3个互补决定区CD R1、 CDR2、 CDR3； 其中， FR1的氨基酸序列 如SEQ ID NO.2所示， FR2的氨基酸序列如SEQ  ID NO.3所示， FR3的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.4所示， FR4的氨基酸序列如SEQ  ID NO.5所示， CDR1的氨基酸序列如SEQ  ID NO.6所示， CDR2的氨基酸序列如SEQ  ID NO.7所示， CDR3的氨基酸序列如SEQ  ID NO.8所示。 3. 根据权利要求1所述的血清白蛋白结合纳米抗体， 其特征在于， 所述纳米抗体Nb8的 碱基序列如SEQ  ID NO.9所示。 4.一种权利要求1~3任一所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法， 其特征在于， 包 括如下步骤： 采用免疫管法对羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行富 集筛选， 得到噬菌体文库； 将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增， 并进行测序， 根据测序结果合成丰度占比前 10的纳米抗体的基因序列； 将所述纳米抗体的基因序列 克隆至表达载体中得到重组质粒， 将所述重组质粒转入宿 主细胞中诱 导表达并进行 纯化、 筛选， 得到血清白蛋白结合纳米抗体。 5.根据权利要求4所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法， 其特征在于， 采用免疫 管法对羊驼 源噬菌体展示纳米抗体文库进 行富集筛选的步骤中， 包括： 提供目的蛋白， 将所 述目的蛋白包被在免疫管 上， 进行2~3轮富集筛选。 6. 根据权利要求5所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法， 其特征在于， 所述目 的蛋白的浓度为25~30 ug/ml。 7.根据权利要求4所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法， 其特征在于， 所述表达 载体选自PET ‑14B载体。 8.根据权利要求4所述的血清白蛋白结合纳米抗体的制备方法， 其特征在于， 所述宿主 细胞选自大肠杆菌 。 9.权利要求1~3任一所述的血清白蛋白结合纳米抗体在制备增强药物半衰期的药物中 的应用。 10.权利要求1~3任一所述的血清白蛋白结合纳米抗体在制备肿瘤细胞成像的试剂中 的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115028719 A 2血清白蛋白结 合纳米抗体及其制备方 法与应用 [0001] 技术领域 [0002]本发明涉及纳 米抗体技术领域， 尤其涉及 一种血清白蛋白结合纳 米抗体及其制备 方法与应用。 [0003]  背景技术 [0004]增加药物在血液循环的时间， 是发挥药物的作用的一个重要前提， 各种纳米抗体 偶联药物的一个重要缺陷就是较短的半衰期， 这主要 是由于纳米抗体相关药物较小的分子 量导致的肾脏的快速清除。 通过使用与血清白蛋白偶联或与血清白蛋白结合蛋白偶联进 行 修饰， 可以直接增加药物整体分子量， 使其超过肾脏对蛋白滤过的阈值 （＞40 ‑50kDa， 2 ‑ 6nm） ， 同时实现通过新生儿Fc受体 （neonatal  Fc receptor,  FcRn） 进行再循环， 从而整体 导致药物半衰期延 长， 同时也增加药物效率， 并减少药物的使用量。 各种通过与血清白蛋白 结合多肽、 蛋白甚至抗体对药物进行修饰， 已经被大量使用。 [0005]纳米抗体(nanobo dy, Nb)是在重链抗体可变 区片段 (variable domain of the  heavy chain of heavychain  antibody,  VHH) 基础上改造成一种 仅由重链可变区组成的 单域抗体  (single domain antibody,  sdAb)， 即重链单域抗体； 其相对分子量约 为15KD, 只有普通抗体的1/10左右。 纳米抗体天然存在于羊驼和鲨鱼等血液中。 纳米抗体虽然小， 相 对于普通抗体， 纳米抗体仅有3个互补决定区(complementarity  determining  region,  CDR)， 但是却具备较好的特异抗原结合能力和高亲合力， 是具有完整生物学功能的最小单 位抗体。 这种特殊结构不仅具有普通纳米抗体的优势， 而且还具备一些独特性。 首先， 纳米 抗体只有一个结构域， 没有普通抗体的Fc段， 不会出现由Fc段引起的补体效应。 其次是纳米 抗体的VHH中的部 分疏水基团被亲水基团取代， 使 得纳米抗体的水溶性大大增加， 可以大大 提高作为药物的利用率； 纳米抗体能够识别独特 的构造表位， 比常规抗体有更广泛的抗原 识别能力， 同时纳米抗体有着较长的CDR3,  可形成稳定的暴露的凸环结构， 能够深入抗原 内部以更好的结合抗原从而提高了其抗原特异性和亲和力,因此纳米抗体VHH单域具有更 加广泛的抗原结合力。 最后， 由于纳米抗体 分子质量小， 且纳米抗体于与人类抗体的VH序列 高度同源， 所以纳米抗体对人体的免疫原性较弱， 纳米抗体重复给药一般不会引起任何体 液和细胞的免疫应答。 [0006]同时纳米抗体具有强而快的组织穿透能力， 可以进入实体肿瘤而发挥作用， 纳米 抗体也可以透过血脑屏障， 可以开发出一系列诊断和治疗脑部疾病的显影剂和新药； 纳米 抗体分子质量小， 结构简单， 由单一基因编 码， 很容易在大肠杆菌和酵母等微生物中大量表 达， 其制作成本低， 简单 方便， 可以在短时间内获得功能性 抗体制剂。 [0007]通过与血清白蛋白结合的纳 米抗体对药物进行修饰， 也正逐渐被用于各种药物修 饰， 尤其是纳米抗体偶联药物， 通过与血清白蛋白纳米抗体进 行融合， 再将细胞毒性药物进说　明　书 1/6 页 3 CN 115028719 A 3