(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210585302.4 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 华兰基因工程有限公司 地址 453000 河南省新乡市平 原示范区黄 河路甲1-1号 (72)发明人 张静静　安文琪　王斌　邢体坤　 宋路萍　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 张立娜 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01)C07K 1/22(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/36(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种抗PD-L1的人源化纳米抗体及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种抗PD ‑L1的人源化纳米抗 体及其应用。 本发明提供的纳米抗体， 包含3个互 补决定区， 其中CDR1的氨基酸序列为SEQ  ID  No.4， CDR2的氨基酸序列为SEQ  ID No.6， CDR3的 氨基酸序列为SEQ  ID No.9。 本发明在抗PD ‑L1的 骆驼源纳米抗体基础上， 通过人源化改造和实验 验证， 抗PD ‑L1人源化纳米抗体M2(SEQID  No.11) 和M5(SEQ  ID No.12)亲和力分别提高2.54， 6.47 倍， 获得特异性结合PD ‑L1的人源化纳米抗体， 克 服骆驼源纳米抗体在临床应用的局限性， 预期用 于治疗PD ‑L1表达的肿瘤或PD ‑L1蛋白的诊断检 测。 权利要求书3页 说明书8页 序列表6页 附图2页 CN 115433281 A 2022.12.06 CN 115433281 A 1.纳米抗体， 包 含3个互补决定区； 所述3个互补决定区为CDR 1、 CDR2和CDR3； 所述CDR1的氨基酸序列为SEQ  ID No.4； 所述CDR2的氨基酸序列为SEQ  ID No.6； 所述CDR3的氨基酸序列为SEQ  ID No.9。 2.根据权利要求1所述的纳米抗体， 其特征在于： 所述纳米抗体除了包含所述互补决定 区外还包含4个框架区； 所述 4个框架区分别为FR 1、 FR2、 FR3和FR4； 所述FR1的氨基酸序列为SEQ  ID No.2或SEQ ID No.3； 所述FR2的氨基酸序列为SEQ  ID No.5； 所述FR3的氨基酸序列为SEQ  ID No.7或SEQ ID No.8； 所述FR4的氨基酸序列为SEQ  ID No.10。 3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体， 其特征在于： 所述纳米抗体为下述A1)或A2)或 A3)或A4)： A1)氨基酸序列如SEQ  ID No.11所示的纳米抗体； A2)氨基酸序列如SEQ  ID No.12所示的纳米抗体； A3)在SEQ  ID No.11所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的纳米抗 体； A4)在SEQ  ID No.12所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的纳米抗 体。 4.与权利要求1或2或3所述纳米抗体相关的生物材 料， 为B1)至B12)中的任一种： B1)编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有B1)所述核酸分子的重组微 生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微 生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微 生物； B8)含有B4)所述重组载体的重组微 生物； B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系； B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系； B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系； B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。 5.根据权利要求4所述的生物材料， 其特征在于： 所述纳米抗体的CDR1的编码序列为 SEQ ID No.13的第142 ‑156位核苷酸或SEQ  ID No.14的第142 ‑156位核苷酸； 和/或 所述纳米抗体的CDR2的编码序列为SEQ  ID No.13的第208 ‑228位核苷酸或SEQ  ID  No.14的第208 ‑228位核苷酸； 和/或 所述纳米抗体的CDR3的编码序列为SEQ  ID No.13的第343 ‑399位核苷酸或SEQ  ID  No.14的第343 ‑399位核苷酸。 6.根据权利要求 4或5所述的生物材 料， 其特征在于： B1)所述核酸分子为如下任一：权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115433281 A 2C1)核苷酸序列如SEQ  ID No.13的第67 ‑432位或SEQ  ID No.14的第67 ‑432位所示的 DNA分子； C2)核苷酸序列如SEQ  ID No.13的第7 ‑432位或SEQ  ID No.14的第7 ‑432位所示的DNA 分子； C3)核苷酸序列如SEQ  ID No.13或SEQ  ID No.14所示的DNA分子； C4)在严格条件下与C1) ‑C3)中任一限定的DNA分子杂交且编码所述纳米抗体 的DNA分 子； C5)与C1) ‑C4)中任一限定的DNA序列具有99％以上、 95％ 以上、 90％以上、 85％以上或 者80％以上同源性且编码所述纳米抗体的DNA分子 。 7.含有权利要求1或2或3所述纳米抗体结构的多肽分子； 进一步地， 所述多肽分子为如下任一： D1)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的单链抗体； D2)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的Fab； D3)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的完整抗体； D4)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的融合 抗体； D5)含有权利要求1或2或3所述纳米抗体的抗体药物偶联物。 8.含有权利要求1 ‑3中任一所述纳米抗体或权利要求4 ‑6中任一所述生物材料或权利 要求7所述多肽分子的试剂盒。 9.权利要求1或2或3所述纳米抗体的制备方法， 包括如下步骤： 将编码权利要求1或2或 3所述纳米抗体的核酸分子导入宿主细胞得到表达所述纳米抗体的重组宿主细胞， 培养所 述重组宿主细胞， 得到所述纳米抗体； 进一步地， 在培养所述重组宿主细胞后还包括如下步骤： 首先通过渗透休克法得到周 质空间蛋白， 接着将所述周质空间蛋白依次通过亲和层析和超滤换液进 行纯化获得所述纳 米抗体； 和/或 进一步地， 编码所述纳米抗体的核酸分子为权利要求5或6中所述核酸分子； 和/或， 进一步地， 所述宿主细胞为 微生物细胞。 10.如下任一应用： E1)权利要求1或2或3所述纳米抗体在制备用于检测P D‑L1的产品中的应用； E2)权利要求 4‑6中任一所述 生物材料在制备用于检测P D‑L1的产品中的应用； E3)权利要求7 所述多肽分子在制备用于检测P D‑L1的产品中的应用； E4)权利要求8所述试剂盒在制备用于检测P D‑L1的产品中的应用； E5)权利要求9所述方法在制备用于检测P D‑L1的产品中的应用； E6)权利要求1或2或3所述纳米抗体在制备与P D‑L1结合的产品中的应用； E7)权利要求 4‑6中任一所述 生物材料在制备与P D‑L1结合的产品中的应用； E8)权利要求7 所述多肽分子在制备与P D‑L1结合的产品中的应用； E9)权利要求8所述试剂盒在制备与P D‑L1结合的产品中的应用； E10)权利要求9所述方法在制备与P D‑L1结合的产品中的应用； E11)权利要求1或2或3所述纳米抗体在制 备用于诊断或治疗表达PD ‑L1的肿瘤的产品 中的应用；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115433281 A 3