(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210602549.2 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市长安 南路199号 (72)发明人 高平　杨娟　董小明　李琪　 (74)专利代理 机构 西安恒泰知识产权代理事务 所 61216 专利代理师 李郑建 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 7/01(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 31/7088(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其应 用 (57)摘要 本发明公开了一种抑制VSTM2L表达的慢病 毒载体及其制备方法， 该慢病毒载体含shRNA 的 核苷酸序列为两条， 分别为： VSTM2L ‑shRNA1： GCAGCAACATCTCCCACAAGCVSTM2L ‑shRNA2： CAGCAACATCTCCCACAAGCT。 所述慢病毒载体是通 过将抑制VS TM2L表达的shRNA核苷酸序列插入慢 病毒载体pLKO.1所得。 或者慢病毒载体与慢病毒 包装 质粒 pMD2 .G 、 ps PAX 2通过脂 质体 Lipofectamine  2000TM共转染HEK293T细胞获得 特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。 经实验表明， 上述shRNA或慢病毒载体或慢病毒能够有效且 稳 定抑制VSTM2L在人源前列腺癌细胞中的表 达， 能 在制备抑制人前列腺癌细胞的增殖、 迁移及克隆 形成能力的药物中应用。 同时， 也可应用于 VSTM2L基因在人前列腺癌发生发展中的作用及 机制研究。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图5页 CN 114854755 A 2022.08.05 CN 114854755 A 1.一种抑制VSTM2L表达的shRNA， 其特征在于， 所述shRNA的核苷酸序列为两条， 分别 为： VSTM2L‑shRNA1： GCAGCA ACATCTCCCACAAGC VSTM2L‑shRNA2： CAGCAACATCTCCCACAAGCT。 2.一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体， 其特征在于， 该慢病毒载体含有权利要求1所述 shRNA的核苷酸序列。 3.如权利 要求2所述的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体， 其特征在于， 所述慢病毒载体是 通过将抑制VSTM2L表达的shRNA核苷酸序列插 入慢病毒载体pLKO.1所 得。 4.如权利 要求2所述的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体， 其特征在于， 所述慢病毒载体与 慢病毒包装质粒pMD2.G、 psPAX2通过脂质体 Lipofectamine  2000TM共转染HEK293T细胞获得 特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。 5.权利要求2 ‑4其中之一所述的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体的构建方法， 其特征在 于， 具体包括： 合成用于编码VSTM2L的核苷酸片段； 分别利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和AgeⅠ对 pLKO.1慢病毒 载体进行双酶切； 制备VSTM2L基因的shRNA； 连接双酶切慢病毒 载体和制备好 的shRNA片段； 转 化鉴定后所提取的质粒即为特异性抑制VSTM2L表达的shRNA 慢病毒载体。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 利用慢病毒包装质粒pMD2.G、 psPAX2与重组 VSTM2L慢病毒载体通过脂质体Lipofectamine2000TM共转染HEK293T细胞后， 即可得到特异 性抑制VSTM2L表达的慢病毒。 7.权利要求2 ‑4其中之一所述的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体， 用于制备抑制前列腺 癌细胞增殖和迁移药物中的应用。 8.如权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所制备抑制前列腺癌细胞增殖和迁移药物能 够有效抑制VSTM2L在前列腺癌细胞中的表达， 从而抑制前列腺癌细胞的增殖、 迁移及克隆 形成。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854755 A 2一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其应用 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 涉及一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其应 用。 背景技术 [0002]前列腺癌是全世界范围内最常见的男性恶性肿瘤之一。 在前列腺癌患者当中早期 患者治愈率较高， 而中晚期患者治愈率低并且预后较差。 前列腺癌的发病机制复杂， 因此寻 找其预后分子靶点， 对于提高前列腺癌 患者预后水平至关重要。 [0003]经申请人进行的资料检索， 截止目前为止， 现有基因编辑技术中， 并没有抑制 VSTM2L在癌细胞中表达的慢病毒载体的相关文献和技 术专利及研究报道。 发明内容 [0004]本发明的目的在于， 提供一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其应用， 通过此慢 病毒载体可以特异、 持续、 稳定、 高效的抑制VSTM2L在癌细胞中的表达 。 [0005]为了实现上述任务， 本发明采用如下的技 术解决方案： [0006]一种抑制VSTM2L表达的shRNA， 其特征在 于， 所述shRNA的核苷酸序列为两条， 分别 为： [0007]VSTM2L‑shRNA1： GCAGCA ACATCTCCCACAAGC [0008]VSTM2L‑shRNA2： CAGCAACATCTCCCACAAGCT。 [0009]一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体， 其特征在 于， 该慢病毒载体含有权利要求1所 述shRNA的核苷酸序列。 [0010]具体的， 所述慢病毒载体是通过将抑制VSTM2L表达的shRNA核苷酸序列插入慢病 毒载体pLKO.1所 得。 [0011]或者， 所述慢病毒载体与慢病毒包装质粒pMD2 .G、 psPAX2通过脂质体 Lipofectami ne 2000TM共转染HEK293T细胞获得 特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。 [0012]上述抑制VSTM2L表达的慢病毒载体的构建方法， 其特征在 于， 具体包括： 合成用于 编码VSTM2L的核苷酸片段； 分别利用限制性内切酶EcoR  Ⅰ和AgeⅠ对pLKO.1慢病毒载体进行 双酶切； 制备VSTM2L基因的  shRNA； 连接双酶切慢病毒载体和制备好的shRNA片段； 转化鉴 定后所提取的质粒即为特异性抑制VSTM2L表达的shRNA 慢病毒载体。 [0013]或者， 利用慢病毒包装质粒pMD2.G、 psPAX2与重组VSTM2L慢病毒载体通过脂质体 Lipofectami ne 2000TM共转染HEK293T细胞后， 即可 得到特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。 [0014]经申请人的实验表明， 上述抑制VSTM2L表达的慢病毒载体能够在制备抑制前列腺 癌细胞增殖、 迁移及克隆形成的药物中的应用。 [0015]所制备抑制前列腺癌细胞增 殖迁移药物能够有效抑制VSTM2L在前列腺癌细胞中 的表达， 从而抑制前列腺癌细胞的增殖、 迁移及克隆形成。 [0016]本发明的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体， 填补了现有技 术领域的空白， 具体如下：说　明　书 1/5 页 3 CN 114854755 A 3