(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210595579.5 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 优赛医疗科技 （天津） 有限公司 地址 300457 天津市滨 海新区天津自贸试 验区 （空港经济区） 国际物流区第三大 街8号326号 （北创益员 （天津） 商务秘 书有限公司托管第BCX807号） (72)发明人 冯春玲　陈晓波　韩颢　韩洪起　 吴学涛　 (74)专利代理 机构 天津市尚仪知识产权代理事 务所(普通 合伙) 12217 专利代理师 孙乔乔 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效 果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂 (57)摘要 本发明公开了一种来源于肿瘤组织的具有 肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法 和细胞制剂。 本发明通过对肿瘤组织进行消化分 离， 获得的种子细胞， 给予连续刺激并使用特定 培养基进行扩增培养， 在较短培养周期内即可获 得满足制剂需求的细胞数量并制成细胞悬液。 本 发明采用连续刺激加定向培养的扩增方式， 在细 胞接种初始即给予刺激， 相比传统培养方法先扩 增种子细胞数再刺激的方式， 可大大提高细胞扩 增效率， 缩短培养周期， 使细胞维持高水平的生 物活性。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 114672457 A 2022.06.28 CN 114672457 A 1.一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法， 其特征 在于： 包括以下步骤： S1.将肿瘤组织进行清洗、 分割， 放入消化液中震荡消化3 0‑40min； S2.组织消化后过滤、 洗涤、 离心， 用T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到预先包被 的培养瓶中， 补加IFN ‑γ至终浓度1000 ‑1500IU/ml， 进行细胞培养； 所述包被的培养瓶的方 法为： 用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃， 5.0%  CO2条件 下0.5‑1h； S3.每日观察细胞状态， 取样计数， 根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基， 调整细胞 浓度在0.5 ‑0.8×109/L， 继续细胞培 养； S4.继续每日观察细 胞状态， 当培养体系达到10 ‑15ml时， 取样计数， 将细胞转移至预先 包被的培养瓶中， 包被方法同步骤S2； 根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基， 调整细胞 浓度在0.5 ‑0.8×109/L， 补加IFN ‑γ至终浓度10 00‑1500IU/ml， 继续细胞培 养； S5.继续每日观察细 胞状态， 取样计数， 当培养体系达到25 ‑45ml时， 将细胞转入另一培 养瓶中， 根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基， 调整细胞浓度在0.5 ‑0.8×109/L， 继续 细胞培养； S6.继续每日观察细 胞状态， 取样计数， 当培养体系达到180 ‑200ml时， 将细 胞转入细 胞 培养袋中， 按照20 ‑50ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗， 根据计数结果补加T淋巴细胞 完全培养基， 调整细胞浓度在0.5 ‑0.8×109/L， 继续细胞培 养； S7.继续每日观察细胞状态， 取样计数， 当培养体系达到1600 ‑2000ml且细 胞总数在4 × 109以上时， 收获全部细胞。 2.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细 胞的制备 方法， 其特 征在于： 步骤S1中， 每立方厘米组织 块加入10 ‑15ml消化液。 3.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细 胞的制备方法， 其特征在于： 步骤S1中， 消化液为含有0.075 ‑0.15g/ml的 Ⅰ型胶原酶的1640 培养基。 4.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细 胞的制备方法， 其特征在于： T淋巴细胞完全培养基为含有10 ‑20 v%胎牛血清、 2  v% 50X必 需氨基酸和40 00‑6000IU/ml IL‑2的X‑VIVO 15培养基。 5.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细 胞的制备 方法， 其特 征在于： 步骤S2中， CD3和CD28两种单抗的含量 为20‑50ng/cm2。 6.一种权利要求1 ‑5任一所述制备方法制备得到的来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性 杀伤效果的T淋巴细胞。 7.一种肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂， 其特征在于： 包括权利要求6所述的来 源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672457 A 2来源于肿瘤组织的 具有肿瘤特异性杀伤效果 的T淋巴细胞及 其制备方 法和细胞制剂 技术领域 [0001]本发明涉及T淋巴细胞制剂领域， 特别涉及一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异 性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备 方法和细胞制剂。 背景技术 [0002]近几年， 随着生物医药领域的迅猛发展， 免疫疗法逐渐成为继手术、 放疗、 化疗后 第四类肿瘤治疗手段， 其中过继性细胞治疗、 免疫检查点阻断疗法、 肿瘤 疫苗以及双特异 性 抗体等治疗方法均取得了一定的临床疗效。 然而在实体瘤发展过程中， 实体肿瘤的物理屏 障及其复杂的肿瘤微环境限制了非特异性免疫 治疗的疗效。 来自肿瘤内部或肿瘤组织附近的肿瘤组织浸润性淋巴细胞， 对肿瘤细胞具有特异 性识别能力， 在1922年首次被提到， Mac  carty推测淋巴细胞到肿瘤组织内是体内免疫系统 抵抗肿瘤的一种现象， 提出了肿瘤组织浸润性淋巴细胞是一种高效抗癌的免疫效应细胞。 1986年Rosenberg等人在荷瘤小鼠的肿瘤组织内发现并分离出了肿瘤组织浸润性淋巴细 胞， 他们将分离出的细胞经过体外扩增培养后， 再回输到荷瘤小鼠体内， 发现肿瘤组织有明 显消退， 从而证明肿瘤组织浸润性淋巴细胞 具有抗肿瘤的作用。 [0003]常规的肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞培养方法， 多采用两步法进行培养， 先用高浓度 的IL‑2扩增细胞数量， 再用CD3单抗、 CD28单抗或辐照的人外周血PBMC等对细胞进行刺激以 提高效应细胞的比例， 培养周期通常在20 ‑25天， 也有研究培养到36天， 此方法最后收获的 细胞， 往往生物活性均有所降低， 并且最终制剂 中含有较高比例的调节性T淋巴细胞， 严重 影响临床治疗效果。 发明内容 [0004]本发明为了解决上述技术问题， 提供了一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀 伤效果的T淋巴细胞及其制备 方法和细胞制剂。 [0005]第一方面， 本发明提供一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴 细胞的制备 方法， 是通过以下技 术方案得以实现的。 [0006]一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制 备方法， 包括 以下步骤： S1.将肿瘤组织进行清洗、 分割， 放入消化液中震荡消化3 0‑40min； S2.组织消化后过滤、 洗涤、 离心， 用T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到预先 包被的培养瓶中， 补加IFN ‑γ至终浓度1000 ‑1500IU/ml， 进行细胞培养； 所述包被的培养瓶 的方法为： 用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃， 5.0%  CO2 条件下0.5 ‑1h； S3.每日观察细胞状态， 取样计数， 根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基， 调整 细胞浓度在0.5 ‑0.8×109/L， 继续细胞培 养；说　明　书 1/7 页 3 CN 114672457 A 3