(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210603151.0 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新 技术开发 区科学大道100号 (72)发明人 张慧娟　王亚萍　齐梓君　曹可轩　 侯琳　张振中　 (74)专利代理 机构 郑州银河专利代理有限公司 41158 专利代理师 严艳丽 (51)Int.Cl. A61K 31/704(2006.01) A61K 31/4706(2006.01) A61K 9/52(2006.01) A61K 47/42(2017.01)A61K 47/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 胰腺癌化疗-免疫治疗递药系统的制备方法 及其应用 (57)摘要 本发明涉及胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统 的制备方法及其应用， 有效解决胰腺癌基质屏障 和免疫逃避问题， 具体步骤如下： （1） 双载药白蛋 白纳米粒的制备； （2） 双载药白蛋白纳米粒和 HAases共包覆 EcN的制备。 本发明制备方法简单， 该系统利用EcN和人血清白蛋白的共靶向作用， 在透明质酸酶的辅助下， 穿透基质屏障， 将纳米 粒送达肿瘤深层部位； DOX具有化疗和诱导免疫 原性细胞死亡的双重作用； HCQ调控肿瘤细胞自 噬行为， 逆转深度免疫抑制性微环境， 放大化疗 药的ICD效应； EcN能够增 强免疫治疗效果， 从而 有效解决了胰腺癌基质屏障和免疫逃避问题。 权利要求书2页 说明书7页 CN 114917238 A 2022.08.19 CN 114917238 A 1.一种胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统的制备方法， 其特征在于， 具体步骤如下： （1） HCQ‑DOX@HSA的制备： 取1 ‑8mg的GSH加入到1 ‑5mL超纯水中， 涡 旋、 溶解， 得GSH 水溶液； 取10 ‑ 40mg的HSA加入到1 ‑5mL超纯水中， 涡旋、 溶解， 得HSA水溶液， 将GSH水溶液加入到HSA水溶液 中， 在37℃条件下搅拌反应30 ‑120min， 得到还原性的人血清白蛋白， 用饱和Na2CO3水溶液调 节pH至7‑10， 再加入2 ‑10mg的DOX和2 ‑10mg的HCQ搅拌8 ‑15h， 滴加100 ‑200 μL的3%过氧化氢 溶液， 反应10 ‑60min， 转移至MWCO=100kD的透析袋中， 用超纯水透析4 ‑12h除去游离药物， 即 得HCQ‑DOX@HSA； （2） HCQ‑DOX@HSA‑EcN‑HAases的制备： 用LB肉汤培养基培养EcN， 得108CFU/mL的EcN菌 液， 取0.5 ‑1.5mL浓度为108CFU/mL的EcN菌液， 重悬在0.5 ‑3mL的8‑25mmol/L  CaCl2水溶液 中， 超声10 ‑60min， 得到EcN ‑Ca2+， 使EcN菌液表面带正电， 滴加1 ‑5mL HCQ‑DOX@HSA和 1mgHAases， 25 ‑28℃下， 搅拌3 0‑120min， 4000r/min离心10mi n， 弃去上清液， 得沉淀， 即得。 2.根据权利要求1所述的胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统的制备 方法， 其特 征在于， （1） HCQ‑DOX@HSA的制备： 取5mg的GSH加入到2 mL超纯水 中， 涡旋使溶解， 取25mg的HSA加 入到2mL超纯水中涡旋使溶解， 将GSH水溶液加入到HSA水溶液中， 在37℃条件下搅拌反应 50min， 得到还原性的HSA， 用饱和的Na2CO3水溶液调节pH至8， 再加入 5mg的DOX和5mg的HCQ搅 拌10h后， 滴加150 μL的3%过氧化氢溶液， 反应40min， 转移至MWCO=100kD的透析袋中， 用超纯 水透析8h除去游离药物， 即得H CQ‑DOX@HSA； （2） HCQ‑DOX@HSA‑EcN‑HAases的制备： 用LB肉汤培养基培养EcN， 得108CFU/mL的EcN菌 液， 取0.8mL浓度为108CFU/mL的EcN菌液,重悬在1mL的12mmol/L  CaCl2的水溶液中， 超声 25min， 得到EcN ‑Ca2+， 使EcN菌液表面带正电， 滴加2.5mL的HCQ ‑DOX@HSA和1mg  HAases， 26℃ 下， 搅拌40mi n， 4000r/min离心10mi n， 弃去上清液， 得沉淀， 即得。 3.根据权利要求1所述的胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统的制备 方法， 其特 征在于， （1） HCQ‑DOX@HSA的制备： 取5mg的GSH加入到4mL超纯水 中， 涡旋使溶解， 取15mg的HSA加 入到4mL超纯水中涡旋使溶解， 将GSH水溶液加入到HSA水溶液中， 在37℃条件下搅拌反应 50min， 得到还原性的HSA， 用饱和的Na2CO3水溶液调节pH至8， 再加入 5mg的DOX和5mg的HCQ搅 拌10h后， 滴加120 μL的3%过氧化氢溶液， 反应30min， 转移至MWCO=100kD的透析袋中， 用超纯 水透析10 h除去游离药物， 即得H CQ‑DOX@HSA； （2） HCQ‑DOX@HSA‑EcN‑HAases的制备： 用LB肉汤培养基培养EcN， 得108CFU/mL的EcN菌 液， 取0.8mL浓度为108CFU/mL的EcN菌液,重悬在2mL的12mmol/L  CaCl2的水溶液中， 超声 25min， 得到EcN ‑Ca2+， 使EcN菌液表面带正电， 滴加2.5mL的HCQ ‑DOX@HSA和1mg  HAases， 28℃ 下， 搅拌3 0min， 4000r/min离心10mi n， 弃去上清液， 得沉淀， 即得。 4.根据权利要求1所述的胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统的制备 方法， 其特 征在于， （1） HCQ‑DOX@HSA的制备： 取5mg的GSH加入到4mL超纯水 中， 涡旋使溶解， 取15mg的HSA加 入到4mL超纯水中涡旋使溶解， 将GSH水溶液加入到HSA水溶液中， 在37℃条件下搅拌反应 50min， 得到还原性的HSA， 用饱和的Na2CO3水溶液调节pH至8， 再加入 5mg的DOX和5mg的HCQ搅 拌10h后， 滴加120 μL的3%过氧化氢溶液， 反应30min， 转移至MWCO=100kD的透析袋中， 用超纯 水透析10 h除去游离药物， 即得H CQ‑DOX@HSA； （2） HCQ‑DOX@HSA‑EcN‑HAases的制备： 用LB肉汤培养基培养EcN， 得108CFU/mL的EcN菌 液， 取0.8mL浓度为108CFU/mL的EcN菌液,重悬在0.5  mL的12 mmol/L 的CaCl2水溶液中， 超权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114917238 A 2声40min， 得到EcN ‑Ca2+， 使EcN菌液表面带正电， 滴加2mL的HCQ ‑DOX@HSA和1mg  HAases， 25℃ 下， 搅拌80mi n， 4000r/min离心10mi n， 弃去上清液， 得沉淀， 即得。 5.根据权利要求1所述的胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统的制备 方法， 其特 征在于， （1） HCQ‑DOX@HSA的制备： 取3mg的GSH加入到3mL超纯水 中， 涡旋使溶解， 取30mg的HSA加 入到3mL超纯水中涡旋使溶解， 将GSH水溶液加入到HSA水溶液中， 在37℃条件下搅拌反应 90min， 得到还原性的HSA， 用饱和的Na2CO3水溶液调节pH至9， 再加入8mg的DOX和8mg的HCQ搅 拌8h后， 滴加160 μL的3%过氧化氢溶液， 反应50min， 转移至MWCO=100kD的透析袋中， 用超纯 水透析6h除去游离药物， 即得H CQ‑DOX@HSA； （2） HCQ‑DOX@HSA‑EcN‑HAases的制备： 用LB肉汤培养基培养EcN， 得108CFU/mL的EcN菌 液， 取1.2mL浓度为108CFU/mL的EcN菌液,重悬在1mL含25  mmol/L 的CaCl2水溶液中， 超声 50min， 得到EcN ‑Ca2+， 使EcN菌液表面带正电， 滴加5mL  HCQ‑DOX@HSA和1mg  HAases， 27℃下， 搅拌90mi n， 4000r/min离心10mi n， 弃去上清液， 得沉淀， 即得。 6.根据权利要求1所述的胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统的制备方法， 其特征在于， 所 述的HCQ‑DOX@HSA的平均粒径10 0‑300nm。 7.权利要求1至6 中任一项所述的胰腺癌 化疗‑免疫治疗递药系统在制备抗肿瘤药物中 的应用。 8.权利要求7 所述的胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统在制备抗胰腺癌药物中的应用。 9.一种胰腺癌 化疗‑免疫治疗递药系统 的药物组合物， 其特征在于， 该药物组合物包含 上述的胰腺癌化疗 ‑免疫治疗递药系统以及药 学上可接受的载体。 10.根据权利要求9所述的胰腺癌 化疗‑免疫治疗递药系统的药物 组合物， 其特征在于， 所述的药物组合物为注射剂或冻干粉针。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114917238 A 3