(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210595591.6 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 优赛医疗科技 （天津） 有限公司 地址 300457 天津市滨 海新区天津自贸试 验区 （空港经济区） 国际物流区第三大 街8号326号 （北创益员 （天津） 商务秘 书有限公司托管第BCX807号） (72)发明人 吴学涛　陈晓波　王小宇　韩洪起　 冯春玲　 (74)专利代理 机构 天津市尚仪知识产权代理事 务所(普通 合伙) 12217 专利代理师 孙乔乔 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性 杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂 (57)摘要 本发明公开了一种来源于肿瘤患者胸腹水 的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制 备方法和细胞制剂。 本申请通过分离筛选肿瘤患 者胸腹水内的肿瘤特异性T淋巴细胞， 并对符合 要求的种子细胞进行扩增培养， 经CD3和CD28、 IFN‑γ等因子直接刺激， 在短时间内即可获得具 有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。 本申请将 肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的培养周期从 传统方式的25天左右缩短至11 ‑16天， 而且所得 的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞在快速 达到临床治疗 数量级的同时也保证所需T淋巴细 胞的纯度和杀伤活性。 权利要求书1页 说明书6页 附图8页 CN 114672458 A 2022.06.28 CN 114672458 A 1.一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法， 其特征在于： 包括以下步骤： S1.将胸腹水样本 离心、 洗涤， 用培 养基重悬细胞并计数； S2.取2.0 ‑3.0×107个步骤S1获得的细胞加入到 预先包被的细胞培养瓶中， 加入完全培 养基至细胞终浓度0.4 ‑0.6×109/L， 补加IFN ‑γ至终浓度500 ‑2000IU/mL， 进行细胞培养； 细胞培养瓶预先包被的方法为： 用含有CD 3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶 置于37℃， 5.0%  CO2条件下0.5 ‑1 h； S3.培养24h ‑48h后， 取细胞悬液计数， 将其余细胞悬液全部转移至预先包被的细胞培 养瓶中， 细胞培养瓶包被方法同步骤S2； 根据计数结果， 补加完全培养基将细胞浓度调整为 0.4‑0.6×109/L， 补加IFN ‑γ至终浓度5 00‑2000IU/mL， 进行细胞培 养； S4.每日观察细胞状态， 每间隔24h取细胞悬液计数， 根据细胞计数补加完全培养基将 细胞浓度调整至 0.4‑0.6×109/L， 进行连续培养； S5.当培养体系总体积为180 ‑200mL时， 取细胞悬液计数， 将其余细胞悬液全部转移至 细胞培养袋中， 根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4 ‑0.6×109/L， 按照20 ‑ 50ng/mL向培 养袋中补加CD3和CD28单抗， 继续进行细胞培 养； S6.每日观察细胞状态， 每间隔24h取细胞悬液计数， 根据细胞计数补加完全培养基将 细胞浓度调整至 0.4‑0.6×109/L， 进行连续培养； S7.当培养体系终体积达到1.6 ‑2.0 L时， 每日进行细胞计数， 直到细胞浓度增至2.0 ‑ 2.5×109/L时， 回收全部细胞。 2.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T 淋巴细胞的制备方法， 其特征在于： 所述完全培养基为含有10 ‑20 v%胎牛血清、 4000 ‑6000  IU/mL白细胞介素2和2  v% 50X必需氨基酸的X ‑VIVO 15培养基。 3.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T 淋巴细胞的制备方法， 其特征在于： 步骤S2、 S3中， CD3和CD28两种单抗的含量为20 ‑50ng/ cm2。 4.一种权利要求1 ‑3任一所述制备方法制备得到的来源于肿瘤患 者胸腹水的具有肿瘤 特异性杀伤效果的T淋巴细胞。 5.一种治疗恶性胸腹腔积液的细胞制 剂， 其特征在于： 包括权利要求4所述的来源于肿 瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672458 A 2来源于肿瘤 患者胸腹水的 具有肿瘤特异性杀伤效果 的T淋巴 细胞及其制备方 法和细胞制剂 技术领域 [0001]本发明涉及T淋巴细胞制剂领域， 特别涉及一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿 瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备 方法和细胞制剂。 背景技术 [0002]恶性肿瘤是威胁人类健康的疾病之一。 根据国际癌 症研究机构(IARC)发布的全球 癌症统计数据， 2020年全球新发恶性肿瘤1930万例(不计非黑色素瘤皮肤癌为1810万例), 全球恶性肿 瘤死亡病例约为1000万例(不计非黑色素瘤皮肤癌为990万例)， 是世界范围内 主要死亡原因。 恶性肿瘤己经成为我国主要公共卫生问题， 自2010年来， 恶性肿瘤已经超过 心脑血管疾病， 成为中 国人群第一大死因。 恶性胸腹水又称恶性胸腔积液， 是晚期恶性肿瘤 常见的并发症， 威胁着患者的生命安全， 影响患者的生活质量。 [0003]正常人体内， 胸腹腔和心包腔内仅有少量液体发挥润滑功能， 一般情况下胸腔内 的液体量＜200mL， 腹腔内的液体量＜50mL即可维持正常的心肺功能。 当胸腹腔出现恶性肿 瘤细胞浸润或炎症 时， 腔内积液就会增多， 并且逐渐积聚， 积液的性质也 随之发生变化。 近 年来， 我国恶性肿瘤的发病率逐年攀 升， 恶性胸腹腔 积液病例也日渐增多。 [0004]肿瘤浸润淋巴细胞(tumor ‑infiltrating  lymphocyte,  TIL)是存在于肿瘤间质 内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体， 大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌 巢。 其主要成分是存在于肿瘤间质内的T淋巴细胞， 即具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细 胞， 小部分为MHC非限制性的NK细胞， 其共同特征为表达T细胞受体(T  cell receptor,   TCR)。 TIL细胞治疗肿瘤是当前肿瘤生物学治疗研究的热点之一。 TIL  细胞的优点是： 1.具 有较强的抗肿瘤作用； 2.可特异识别自体肿瘤,  具有特异的MHC限制性溶解肿瘤活性； 3.除 对肿瘤细胞有直接杀伤作用外， 回输后TIL细胞还能增强患者的抗肿瘤免疫功能从而提高 疗效。 [0005]临床所见的大量胸腔积液大约40% 是由恶性肿瘤引起， 最常见的为肺癌、 乳腺癌和 淋巴瘤， 此时患者已不具备手术治疗的条件， 而全身的化疗、 放疗使耐受性较差的患者难以 承受。 自体TIL细胞过继免疫疗法是近年 发展起来治疗恶性胸腔积液的较为成熟、 有效且低 毒的方法。 恶性胸腔积液中的淋巴细胞是一种特殊形式的TIL细胞， 其特点是可对自体内生 长的实体瘤进行 特异性杀伤， 而对其 他种类肿瘤和正常组织细胞则无 杀伤作用。 [0006]肿瘤进展与肿瘤中CD8+T淋巴细胞浸润之间存在相关性， CD8+T细胞被认为直接参 与抗肿瘤细胞毒性反应。 Ahrends等认为CD4+T细胞帮助细胞毒性T细 （CTL） 表达细胞毒性效 应分子， 抑制受体下调和增加迁移能力。 有报道显示， 癌症组织内浸润的CD8+细胞的数量与 患者预后呈正相关， 其数量越多， 预后就越好。 [0007]综上， 申请人认为分离筛选肿瘤患者胸腹水内的肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细 胞并对符合要求的种子细胞进行扩增培养， 快速获得临床治疗数量的特异性T淋巴细胞具 有重要的意 义。说　明　书 1/6 页 3 CN 114672458 A 3