(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210603407.8 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 广州国家实验室 地址 510005 广东省广州市海珠区广州国 际生物岛星岛环北路9号 (72)发明人 刘会生　陈利华　王楠楠　孟皓　 陈婧仪　张枫　廖志赢　徐涛　 (74)专利代理 机构 北京睿阳联合知识产权代理 有限公司 1 1758 专利代理师 张颖 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/0735(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) A61K 35/39(2015.01)A61P 3/10(2006.01) A61P 5/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用 (57)摘要 本发明提供了体外诱导获得胰岛δ细胞的 方法， 培养基及其应用。 权利要求书5页 说明书22页 序列表2页 附图7页 CN 115011544 A 2022.09.06 CN 115011544 A 1.体外诱 导获得胰岛δ细胞的方法， 所述方法包括： (1)获得胰腺前体细胞的步骤， (2)培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤， 以及 (3)培养胰腺内分泌细胞获得胰岛δ细胞的步骤， 任选地， 步骤(2)包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF的培 养基培养。 2.根据权利要求1所述的方法， 步骤(1)中， 胰腺前体细胞通过培养干细胞获得， 优选地 所述干细胞选自多能干细胞、 胰腺干细胞、 成体干细胞或胚胎干细胞； 优选地， 所述干细胞 选自人源干细胞； 优选地， 步骤(1)包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF 7的培养基培养， 优选地， 所述成纤维细胞生长因子FGF 7的浓度在10 ‑200ng/ml的范围内。 3.根据权利要求1所述的方法， 步骤(2)和/或(3)中， 培养基中不添加 成纤维细胞生长 因子FGF， 优选地， 步骤(2)中， 在含有选自视黄酸(RA)、 平滑化拮抗剂、 BMP  1型受体抑制剂、 蛋白激酶C激活剂、 rho激酶抑制剂、 Alk5抑制剂、 ZnSO4、 三碘甲状腺原氨酸(T3)、 γ ‑分泌酶 抑制剂、 重组人β 细 胞素(Human  Recombinant  Betacellulin)、 肝素(Heparin)、 Axl抑制剂 和N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸中的至少一种组分的培养基中培养胰腺前体细胞得到胰腺内分泌 细胞； 优选地， 所述平滑化拮抗剂选自SANT1， 所述BMP  1型受体抑制剂选自LDN193189和/或 Noggin， 所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP， 所述rho激酶抑制剂选自Y27632， 所述 Alk5抑制剂选自ALK5i Ⅱ， 所述γ‑分泌酶抑制剂选自compound  E， 所述Axl抑制剂选自 R428； 步骤(3)中， 在含有三碘甲状腺原氨酸(T3)、 肝素(Heparin)、 ZnSO4、 (±)‑α‑生育酚的培 养基中培 养胰腺内分泌细胞 得到胰岛δ细胞。 4.根据权利要求1所述的方法， 步骤(2)中， 所述成纤维细 胞生长因子FGF为选自FGF1亚 科、 FGF4亚科、 FGF 7亚科、 FGF8亚科、 FGF9亚科或FGF19亚科中的至少一种FGF， 优选地， 所述成纤维细 胞生长因子FGF为选自FGF7亚科中的至少一种FGF， 优选地， 所述 成纤维细胞生长因子FGF为FGF 7和/或FGF10， 优选地， 所述成纤维细 胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF， 优选地， 所述 成纤维细胞生长因子FGF为FGF2， 优选地， 所述成纤维细 胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF和选自FGF7亚 科中的至少一种FGF， 优选地， 所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2和FGF 7， 优选地， 所述成纤维细 胞生长因子FGF为选自FGF4亚科中的至少一种FGF， 优选地， 所述 成纤维细胞生长因子FGF为FGF4， 优选地， 所述成纤维细 胞生长因子FGF为选自FGF9亚科中的至少一种FGF， 优选地， 所述 成纤维细胞生长因子FGF为FGF9， 优选地， 所述成纤维细 胞生长因子FGF为选自FGF8亚科中的至少一种FGF， 优选地， 所述 成纤维细胞生长因子FGF为FGF8， 优选地， 所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF19亚科中的至少一种FGF， 优选地， 所 述成纤维细胞生长因子FGF为FGF21， 优选地， 添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中， FGF2的浓度在2 ‑100ng/ml的范围 内，权　利　要　求　书 1/5 页 2 CN 115011544 A 2优选地， 添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中， FGF4的浓度在100 ‑400ng/ml的范围 内， 优选地， 添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中， FGF7的浓度在2 ‑200ng/ml的范围 内， 优选地， 添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中， FGF10的浓度50 ‑200ng/ml的范围 内， 优选地， 添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中， FGF8的浓度在2 ‑100ng/ml的范围 内， 优选地， 添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中， FGF9的浓度在50 ‑200ng/ml的范围 内， 优选地， 添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中， FGF21的浓度在50 ‑100ng/ml的范围 内， 优选地， 添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中， FGF2的浓度在2 ‑100ng/ml的范围 内， 并且FGF 7的浓度在2 ‑200ng/ml的范围内。 5.根据权利要求2所述的方法， 步骤(1)通过培 养干细胞获得胰腺前体细胞， 优选地， 步骤(1)包括培养干细胞获得定型内胚层细胞的步骤， 以及依次在S2培养基和 S3培养基中培养所述定型内胚层细胞获得胰腺前体细胞的步骤， 其中， 所述S2培养基和/或 S3培养基中含有成纤维细胞生长因子FGF 7； 优选地， 所述S2培 养基为在基础培 养基中添加成纤维细胞生长因子FGF 7的培养基； 优选地， 所述成纤维细胞生长因子FGF 7的浓度在10 ‑200ng/ml的范围内； 优选地， 所述S3培养基为在基础培养基中添加成纤维细胞生长因子FGF7、 视黄酸(RA)、 平滑化拮抗剂、 BMP  1型受体抑制剂、 蛋白激酶C激活剂和rho激酶抑制剂的培养基， 优选地， 所述平滑化拮抗剂选自SANT1， 所述BMP  1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin， 所述 蛋白激酶C 激活剂选自P DBU和/或TB BP， 所述rho激酶抑制剂选自Y276 32； 步骤(2)包括依次在S4培养基、 S5培养基和S6培养基中培养所述胰腺前体细胞获得胰 腺内分泌细胞的步骤， 其中S4培 养基和/或S5 培养基中含有所述成纤维细胞生长因子FGF， 优选地， 所述S4培养基为在基础培养基中添加所述成纤维细胞生长因子FGF、 视黄酸 (RA)、 平滑化拮抗剂、 BMP  1型受体抑制剂、 蛋白激酶C激活剂、 rho激酶抑制剂和Alk5抑制剂 的培养基， 优选地， 所述平滑化拮抗剂选自SANT1， 所述BMP  1型受体抑制剂选自LDN193189 和/或Noggin， 所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP， 所述rho激酶抑制剂选自Y27632， 所述Alk5抑制剂选自ALK5i Ⅱ， 优选地， 所述S5培养基为在基础培养基中添加所述成纤维细胞生长因子FGF、 视黄酸 (RA)、 平滑化拮抗剂、 B MP 1型受体抑制剂、 ZnSO4、 Alk5抑制剂、 三碘甲状腺原氨酸(T3)、 γ ‑ 分泌酶抑制剂、 重组人β 细胞素(Human  Recombinant  Betacellulin)和肝素(H eparin)的培 养基， 优选地， 所述平滑化拮抗剂选自SANT1， 所述BMP  1型受体抑制剂选自LDN193189和/或 Noggin， 所述Al k5抑制剂选自ALK5i Ⅱ， 所述γ‑分泌酶抑制剂选自compound  E， 优选地， 所述S6培养基为在基础培养基中添加BMP  1型受体抑制剂、 三碘甲状腺原氨酸 (T3)、 γ‑分泌酶抑制剂、 肝素(Heparin)、 Axl抑制剂、 N ‑乙酰基‑L‑半胱氨酸和ZnSO4的培养 基， 优选地， 所述BMP  1型受体抑制剂选自LDN19 3189和/或Noggin， 所述γ ‑分泌酶抑制剂选权　利　要　求　书 2/5 页 3 CN 115011544 A 3