(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210598105.6 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 山东大学 地址 250199 山东省济南市历城区山大南 路27号 (72)发明人 沈月毛　李小曼　赵生亮　 (74)专利代理 机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 专利代理师 孙振家 (51)Int.Cl. C12P 17/18(2006.01) C12N 15/52(2006.01) C12N 15/74(2006.01) A61K 31/5386(2006.01) A61P 35/00(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种丙氨酰美登 醇及其合成方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种丙氨酰美登醇及其合成方 法和应用。 本发明截取了基因astC中编码A ‑T结 构域的DNA片段和基因contig_44136中编码 TE结 构域的DNA片段， 插入到整合型表达载体pSBT11 上形成杂合基因nrps， 构建表达载体pSBT11 ‑ nrps， 实现了在珍贵橙色束丝放线菌突变株中异 源表达非核糖体多肽合酶基因， 进而制备丙氨酰 美登醇的目的， 并且还通过TE结构域替换， 使杂 合非核糖体多肽合酶可以更高效地识别细菌美 登木素作为氨基受体， 使 得丙氨酰美登醇的产量 达到了0.5mg/L， 有效克服了现有技术中存在的 产量低的问题， 降低了成本， 可 以用于并促进美 登木素抗体偶联物药物的研究、 生产和临床应 用。 权利要求书2页 说明书10页 序列表4页 附图1页 CN 114875095 A 2022.08.09 CN 114875095 A 1.一种丙氨酰美登 醇， 其化学结构如下 所示： 2.如权利要求1所述丙氨酰美登 醇的合成方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)将能够表达非核糖体多肽 合酶的基因工程菌HGF052+pJTU824 ‑asm18+pSBT 11‑nrps 在28～30℃下， 使用Y MG固体培 养基发酵培 养10～14天， 得到固体培 养物； (2)将固体培养物切成1cm见方的小块， 在20～30℃下用体积比为80:15:5的乙酸乙酯/ 甲醇/甲酸浸泡 提取三次， 合并提取 液， 减压及3 5～40℃的温度下浓 缩至干， 得粗提物； (3)将粗提物溶于水中， 使用乙酸乙酯萃取， 乙酸乙酯相减压及35～40℃的温度下浓缩 至干， 得EA提取物； (4)将EA提取物溶于甲醇中， 再经石油醚多次萃取， 甲醇相减压及35～40℃的温度下浓 缩至干， 得甲醇提取物； (5)将甲醇提取物依次经反相硅胶柱层析分离， 凝胶柱层析分离， 薄层层析和正相硅胶 柱层析分离， 然后将组分相同的洗脱液进行合并， 得到丙氨酰美登 醇。 3.如权利要求2所述丙氨酰美登醇的合成方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述基因工程 菌HGF052+pJTU824‑asm18+pSBT1 1‑nrps的构建方法， 包括 步骤如下： (a)以非核糖体多肽合酶基因astC为模板进行PCR扩增， 扩增得到基因astC中编码A ‑T 结构域的DNA片段， PCR引物序列如下： astC‑F:5′ ‑AAAGGAGGCGGACATATG GAGACGAACATGCTG GTGCAGG‑3′， astC‑R:5′ ‑CGACCCACGGAGGTCGAAGAAGCTGTCGCGCG GACCGACC‑3′； (b)以人工合成基 因contig_44136为模板进行PCR扩增， 扩增得到基 因contig_44136中 编码TE结构域的DNA片段， PCR引物序列如下： 44136‑F:5′ ‑CGCGACAGCT TCTTCGACCTCCGTGGGTCGGACGTGCTCG ‑3′， 44136‑R:5′ ‑GACATGAT TACGAATTCAGGGCCGGGTCGGGTCCGTCCCG‑3′； (c)将步骤(1)中所述编码A ‑T结构域的DNA片段和步骤(2)中所述编码TE结构域 的DNA 片段顺序插入到整合型表达载体pSBT11上的Ned  I和EcoR I限制性酶切位点之间， 形成杂 合基因nrps， 所述杂合基因nrps位于ermE*启动子的下游并受其调控， 得到质粒载体 pSBT11‑nrps； (d)将质粒载体pSBT11 ‑nrps转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002， 获得大肠杆菌 ‑放线菌接 合转移供体菌 ET12567/pUZ80 02/pSBT1 1‑nrps； (e)将供体菌ET12567/pUZ8002/pSBT11 ‑nrps与珍贵橙色束丝放线菌突变株HGF052+ pJTU824‑asm18的菌丝体进行接合转移， 得到基因工程菌HGF052+pJTU824 ‑asm18+pSBT11‑ nrps。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875095 A 24.如权利要求3所述丙氨酰美登醇的合成方法， 其特征在于， 步骤(a)中， 所述非核糖体 多肽合酶基因astC基因库登记号为KF813023.1， 所述基因astC中编码A ‑T结构域的DNA片段 的序列如SEQ  ID NO.1所示。 5.如权利要求3所述丙氨酰美登醇的合成方法， 其特征在于， 步骤(b)中， 所述人工合成 基因contig_44136的序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述基因contig_44136 中编码TE结构域的 DNA片段的序列如SEQ  ID NO.2所示。 6.如权利要求3所述丙氨酰美登醇的合成方法， 其特征在于， 步骤(c)中， 所述杂合基因 nrps序列如SEQ  ID NO.3所示。 7.如权利要求2所述丙氨酰美登醇的合成方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述发酵培养 条件为在28℃下培养10天， 所述YMG固体培养基成分以质量百分比计为： 0.4％葡萄糖、 1％ 麦芽提取物、 0.4％酵母提取物、 2％琼脂粉和96.2％蒸馏水。 8.如权利要求2所述丙氨酰美登醇的合成方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 所述提取采用 的甲醇为90～ 95％甲醇； 步骤(5)中， 所述反相硅胶柱填料为C ‑18， 凝胶柱型号为Sephadex  LH‑20， 正相硅胶柱 填料为200～300目； 所述对甲醇提取物进行分离的具体步骤为： 甲醇提取物首先经反相硅 胶柱层析分离， 分别用水、 40％、 60％、 80％、 100％甲醇依次洗脱， 每个组分洗脱1L， 200～ 250mL/份接收， TLC检测， 用CH2Cl2:MeOH＝15:1(v/v)展开， 用浓硫酸和碘化铋钾显色， 合 并 60％洗脱组分； 继续用凝胶柱层析分离， 甲醇洗脱， 3～5mL/管， 合并33～38管； 继续正相硅 胶柱层析分离， 最后用体积比为100:1、 80:1、 50:1的CH2Cl2/MeOH溶液洗脱， 合并80:1洗脱成 分， 得到丙氨酰美登 醇。 9.权利要求1所述丙氨酰美登 醇在制备抗肿瘤药物中的应用。 10.一种抗肿瘤的药物组合物， 其特征在于， 包括权利要求1所述丙氨酰美登醇和一种 或多种药 学上可接受载体或赋 形剂。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875095 A 3