(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210609884.5 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 南通大学 地址 226001 江苏省南 通市崇川区啬园路9 号 (72)发明人 胡宝英　韩潇　 (74)专利代理 机构 南京瑞弘专利商标事务所 (普通合伙) 32249 专利代理师 马玉雯 (51)Int.Cl. C40B 50/06(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/66(2006.01) A61K 31/7088(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 DC-SIGN的shRNA库的构建及其在原发性肝 癌中的应用 (57)摘要 本发明公开了DC ‑SIGN的shRNA库的构建及 其在原发性肝癌中的应用， 构建方法包括以下步 骤： 设计并合成DC ‑SIGN的shRNA的寡核苷酸序 列， 并经高温变性及缓慢降温退火获得双链寡核 苷酸； 之后将所述双链寡核苷 酸连接至经限制性 内切酶酶切线性化处理后的pSilencer  3.0‑H1 混合， 并在T 4DNA连接酶的作用下形 成重组质粒； 将获得的重组质粒按照等比例混合形 成DC‑SIGN 混合shRNA库。 本发明的shRNA库可有效沉 默巨噬 细胞中的DC ‑SIGN表达， 可作为靶向肝癌免疫耐 受的技术手段促进肿瘤的免疫活化， 对于肝癌的 临床治疗具有非常广阔的应用开发前 景。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 115029789 A 2022.09.09 CN 115029789 A 1.一种DC ‑SIGN的shRNA库的构建方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 设计并合成DC ‑SIGN的shRNA的寡核苷酸序列， 并经高温变性及缓慢降温退火获得双链 寡核苷酸； 之后将所述双链寡核苷酸连接至经限制性内切酶酶切线性化处理后的pSilencer   3.0‑H1混合， 并在T4  DNA连接酶的作用下形成重组质粒； 将获得的重组质粒按照等比例混 合形成DC ‑SIGN混合shRNA库。 2.根据权利要求1所述一种DC ‑SIGN的shRNA库的构建方法， 其特征在于， 所述shRNA的 寡核苷酸序列包括多个shRNA靶向序列： shRNA‑1:5’ ‑CAGAACCTGACCCAGCTTAAA‑3’； shRNA‑2:5’ ‑TGGGTGAGCTCTCAGAGA AAT‑3’； shRNA‑3:5’ ‑GATGGGACTTTCAGATCTA AA‑3’； shRNA‑4:5’ ‑GAGGAAGACTGCGCG GAATTT‑3’。 3.根据权利 要求1所述一种DC ‑SIGN的shRNA库的构 建方法， 其特征在于， 所述限制性 内 切酶包括BamHI和Hi ndIII。 4.根据权利 要求1所述一种DC ‑SIGN的shRNA库的构 建方法， 其特征在于， 所述所述 高温 变性及缓慢降温退火获得双链寡核苷酸具体为： 将所述寡核苷 酸序列加热到98℃， 并以0.5 ℃/分钟的速率降温至25℃。 5.根据权利要求1所述的DC ‑SIGN的shRNA库的表达方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)将肝癌单细胞悬液利用荧光基团标记的DC ‑SIGN和CD68抗体进行标记， 进而利用流 式细胞仪分选出DC ‑SIGN+CD68+巨噬细胞并培 养在DMEM/F12条件培 养基中； 2)将克隆成功的重组质粒利用脂质体转染试剂转染至肝癌组织中分离培养的DC ‑SIGN+ CD68+巨噬细胞中， 转染36小时后， 收集细胞样品并利用流式细胞术分析巨噬细胞表面的 DC‑SIGN表达 。 6.根据根据权利 要求5所述的DC ‑SIGN的shRNA库的表达方法， 其特征在于， 所述克隆成 功的重组质粒 具体制备 方法为： 将多个独立的干扰DC ‑SIGN基因表达的shRNA序列克隆至pSilencer  3.0‑H1真核表达 载体中， 通过PCR和DNA测序分析证明重组克隆构建成功。 7.根据根据权利要求5所述的DC ‑SIGN的shRNA库的表达方法， 其特征在于， 所述步骤2) 具体包括以下步骤： 21)将4μg的质粒溶解于100μl的opti ‑mem培养基中， 并在另一EP管中加入12 μl的脂质 体转染试剂和10 0 μl的opti ‑mem培养基， 室温孵 育5min； 22)将质粒和脂质体溶 液混匀， 室温孵 育15min； 23)加入DC ‑SIGN+CD68+巨噬细胞中， 并在20 00rpm中离心6 0min； 24)将上述 转染后的DC ‑SIGN+CD68+巨噬细胞重新在培 养箱中孵 育。 8.根据权利要求1所述的DC ‑SIGN的shRNA库在制备治疗原发性 肝癌药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029789 A 2DC‑SIGN的shRNA库的构建及其在原发性肝癌中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及DC ‑SIGN的shRNA库 的构建及其在原发性肝癌中的应用， 属于生物工   程技术领域领域。 背景技术 [0002]原发性肝癌(简称肝癌)是我国高发的恶性肿瘤之一， 发病率在我国所有肿瘤中居   第五位， 而死亡率高居第二位。 目前肝癌的临床治疗手段有限， 主要包括传统的手术治  疗、 放疗及化疗。 尽管近年来诞生的一些新型 的肿瘤治疗方案如靶向治疗和免疫治疗在  黑色 素瘤等中取得了较好的疗效， 目前肝癌患者依然难于从上述治疗中获益。 肝癌的发  生发展 机制复杂， 其中免疫异常在肝癌发生中扮演 至关重要的角色。 肿瘤免疫耐受是诱  导肝癌发 生的前体条件， 肿瘤内部免疫细胞可创造维持免疫抑制的微环境， 肿瘤相关巨  噬细胞等可 表达分泌PD ‑L1、 TGF‑β和IL‑10等细胞因子， 诱导杀伤性T细胞的功能失  活和凋亡， 从而抑 制免疫系统对肝癌细胞的杀伤。 肝癌的免疫耐受机制非常 复杂， 限制  了其免疫治疗靶点的 开发。 [0003]在肝癌发生中， 巨噬细胞是一类非常关键 的免疫调控细胞。 巨噬细胞即存在促炎 症和免 疫杀伤的群体， 也可分化为促免疫耐受的群体， 这两类不同巨噬细胞群体的比例对 肝癌 免疫微环 境具有举足轻重的作用。 我们近期通过研究发现DC ‑SIGN/CD209是肝癌中一   种特异性的巨噬细胞标志物， 并且DC ‑SIGN仅表达于促免疫耐受的巨噬细胞中。  DC‑SIGN阳 性的巨噬细胞可大量分泌PD ‑L1、 TGF‑β 和IL‑10等免疫耐受细胞因子， 引  起杀伤性T细胞的 失活和肿瘤免疫耐受， 促进肝癌的发生。 发明内容 [0004]为解决上述 技术问题， 本发明提供了如下技 术方案： [0005]一种DC‑SIGN的shRNA库的构建方法， 包括以下步骤： [0006]设计并合成DC ‑SIGN的shRNA的寡核苷酸序列， 并经高温变性及缓慢降温退火获   得双链寡核苷酸； 之后将所述双链寡核苷酸连接至经限制性内切酶酶切线性化处理后的   pSilencer  3.0‑H1混合， 并在T4  DNA连接酶的作用下形成重组质粒； 将获得的重组质粒  按 照等比例混合形成DC ‑SIGN混合shRNA库， 并利用脂质体导入巨噬细胞中， 沉默巨  噬细胞中 DC‑SIGN的表达并转变其 促免疫耐受 活性。 [0007]进一步的， 所述shRNA的寡核苷酸序列包括多个shRNA靶向序列： [0008]shRNA‑1:5’ ‑CAGAACCTGACCCAGCTTAAA‑3’； [0009]shRNA‑2:5’ ‑TGGGTGAGCTCTCAGAGA AAT‑3’； [0010]shRNA‑3:5’ ‑GATGGGACTTTCAGATCTA AA‑3’； [0011]shRNA‑4:5’ ‑GAGGAAGACTGCGCG GAATTT‑3’。 [0012]进一步的， 所述限制性内切酶包括BamHI和Hi ndIII。 [0013]进一步的， 所述所述高温变性及缓慢降温退火获得双链寡核苷酸具体为： 将所述说　明　书 1/4 页 3 CN 115029789 A 3