(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210608414.7 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 合肥工业大 学 地址 230009 安徽省合肥市包河区屯溪路 193号 (72)发明人 肖桂然　闫永平　纪晓雯　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 专利代理师 高宁馨 (51)Int.Cl. C07K 14/79(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) A61K 38/40(2006.01)A61P 31/04(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 8/64(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) A23K 20/147(2016.01) A23L 33/18(2016.01) C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称 一种抗菌肽 及其应用 (57)摘要 本发明涉及基因工程领域， 具体的， 本发明 公开了一种抗菌肽LFcinB ‑W及其表达和应用。 本 发明以牛乳铁蛋白肽 （LFcinB） 为模板， 将第1位、 第3位及第10位氨 基酸进行色氨酸 （Trp） 替换， 设 计出新型高抗菌活性的衍生肽LFcinB ‑W； 利用基 因工程技术构建成重组表达载体pPIC9K ‑ LFcinB‑W， 将重组表达载体电转化至毕赤酵母 GS115中， 通过甲醇诱导分泌性表达出衍生肽 LFcinB‑W； 本发明公开的衍生肽LFcinB ‑W对金黄 色葡萄球菌（ Staphylococcus  aureus ， S.aureus ） 、 大肠杆菌 （ Escherichia  coli， E.coli） 和枯草芽孢杆菌 （ Bacillus  subtilis ， B.subtilis ） 的抑菌活性均高于LFcinB， 且在体 内的抑菌活性也高于LFcinB。 本发明公开的抗菌 肽LFcinB ‑W有望替代抗生素成为一种安全、 绿 色、 高效的理想抗菌剂。 权利要求书1页 说明书10页 附图7页 CN 114790237 A 2022.07.26 CN 114790237 A 1.一种抗菌肽LFci nB‑W， 其特征在于， 所述 抗菌肽的氨基酸序列如SEQ  ID No.1所示。 2.一种抗菌肽LFcinB ‑W， 其特征在于， 所述抗菌肽的核苷酸酸序列如SEQ  ID No.2所 示。 3.一种重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体中含有如SEQ  ID No.2所示序 列。 4.一种宿主细胞/菌株， 其特征在于， 所述宿主细胞/菌株含有重组表达载体， 所述重组 表达载体中含有如SEQ  ID No.2所示序列。 5.根据权利要求 4所述宿主菌株， 其特 征在于， 所述菌株为毕赤酵母GS1 15菌株。 6.根据权利要求 4所述宿主菌株， 其特 征在于， 所述重组表达载体为pPIC9K ‑LFcinB‑W。 7.根据权利要求1所述 抗菌肽LFci nB‑W在制备药物中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述药物是与感染相关的疾病的药物， 优 选所述药物为 抗菌药物、 抗炎药物、 抗肿瘤药物。 9.根据权利 要求1所述的抗菌肽LFcinB ‑W在制备添加剂中的应用， 其特征在于， 所述添 加剂为食品、 保健品、 化妆品或饲料 添加剂中的任意 一种。 10.制备权利要求1所述 抗菌肽LFci nB‑W的方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： （1） 构建重组表达载体， 所述重组表达载体含有如SEQ  ID No.2所示序列； （2） 宿主细胞/细菌活化； （3） 将重组表达载体转 化宿主细胞/细菌， 制备LFci nB‑W表达系统； （4） 诱导LFcinB‑W表达系统表达LFci nB‑W。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114790237 A 2一种抗菌肽及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因工程领域， 具体的， 本发明公开了一种新型抗菌肽LFcinB ‑W及其 表达和应用。 背景技术 [0002]抗生素滥用导致的细菌耐药性已成为全球范围内严重的生态问题， 寻找有效的抗 生素替代品迫在眉睫。 抗菌肽有望替代抗生素成为一种安全、 绿色、 高效的理想抗菌剂。 目 前抗菌肽的生产方式主要有三种： 天然提取、 化学合成和生物工程 发酵。 天然提取过程甚为 复杂且效率低， 无法推广应用； 化学合成成本高昂， 不适合工业化生产； 生物工程发酵是采 用现代工程技术手段， 利用微生物的特定功能， 为人类生产产品的一种技术， 具备质量稳 定、 成本低等优势， 是实现抗菌肽规模化 生产的最佳途径。 [0003]乳铁蛋白肽 （LFcinB， FKCRR  WQWRM KKLGA PSITC VRRAF） 是由牛乳铁蛋白 （Bovine   Lactoferr in， BLF） 经消化 酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的两亲性阳离子 短肽， 具有 杀菌快速、 不易产生抗药性、 热稳定性及水溶性好等优点。 目前LFcinB的研究主要集中在探 究其生物学活性方面， 如何得到高质高量的LFcinB产品是制约其开发应用的关键问题。 研 究者利用大肠杆菌原核表达系统、 动物乳腺表达系统、 毕赤酵母表达系统成功地对LFcinB 进行了体外表达。 CN201510686691.X公开了根据牛乳铁蛋白的氨基酸序列和核苷 酸序列制 备表达载体pPIC9K ‑LfcinB， 并将载体转化到毕 赤酵母GS115宿主细胞， 形成可表达的重组 细胞； 培养宿主细胞， 使其表达LfcinB抗菌肽； 分离浓缩母 液， 加入蛋白抑制剂及保护剂， 经 透析和20%的三羟甲基甘氨 酸—十二烷基硫酸钠—聚丙烯 酰胺凝胶电泳来 获得纯度较高的 牛乳铁蛋白； CN201010133179.X公开了利用牛乳铁蛋白的核苷酸序列构建载体pGHX ‑LCB， 构建重组表达质粒pGEX ‑4T‑2‑LCB， 将重组质粒转化感受态细胞DH5a， 提取被转化的阳性 感 受态细胞DH5a的质粒转化E.coli  BL21， 利用大肠杆菌诱导表达乳铁蛋白。 但是在大肠杆菌 中表达的LFcinB 因为缺乏结构修饰多以包含体的形式表达， 无法分离纯化； 动物乳腺表达 系统操作繁琐、 周期长、 成本高； 而在酵母中的表达研究较少， 产物产量低、 稳定性差、 活性 低。 发明内容 [0004]要解决的问题 目前乳铁蛋白肽的抗菌活性有待进一步提高， 如何通过基 因工程手段提升母肽的 抗菌活性， 将对抗菌肽的品质进一步的提高， 对于本领域技术人员而言是一个重要的挑战。 因此， 本发 明的目的是开 发一种高抗菌活性的新型抗菌肽， 解决现有技术中存在的不 足， 提 供一种新型 牛乳铁蛋白衍 生肽及其表达和应用。 [0005]技术方案 本发明利用通过基因工程手段， 构建了毕赤酵母表达系统分泌性表达出高抗菌活 性的抗菌肽LFcinB ‑W， 为开发 高产、 高效并且作用机制明确的新型抗菌肽提供 理论依据， 对说　明　书 1/10 页 3 CN 114790237 A 3