(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210610942.6 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属协和 医院 地址 430022 湖北省武汉市汉江区解 放大 道1277号 (72)发明人 谢明星　张丽　景伯萍　朱双双　 白莹　何梦荣　易路阳　秦赛梅　 林灵　 (74)专利代理 机构 北京鑫瑞森知识产权代理有 限公司 1 1961 专利代理师 马云华 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2020.01) A61K 47/46(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (54)发明名称 一种基于羊奶源性细胞外囊泡的诊疗性纳 米探针、 制备方法及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种基于羊奶源性细胞外囊 泡的诊疗性纳米探针、 制备方法及其应用， 属于 生物与医药技术领域。 本发明用GMV负载ICG， 并 将N3基团修饰到GMV表面， 成功获得N3‑GMV@ICG 纳米探针。 该纳米探针 水合直径约为200nm， 稳定 性高， 可通过肿瘤的高通透性和滞留效应聚集于 肿瘤位置。 该纳米探针与肿瘤细胞有良好的结合 能力， 可向肿瘤组织递送药物， 增加药物的递送 效率。 且在激光辐照下， 该纳米探针具备良好的 肿瘤光热治疗效能， 此外， 由于GMV固有的抗炎作 用， 本发明的纳米探针可减 轻光热治疗后炎症反 应， 降低肿瘤的复发及转移， 为肿瘤的光热治疗 以及减轻光热治疗后的毒副反应提供了良好基 础。 权利要求书1页 说明书7页 附图8页 CN 114984214 A 2022.09.02 CN 114984214 A 1.一种基于羊奶源性细胞外囊泡GMV的诊疗性纳米探针的制备方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 步骤1)GMV的分离； 步骤2)N3‑GMV@ICG的合成： 首先将ICG的溶解于DMSO， 然后以DMSO为渗透剂将GMV与ICG 混合搅拌获得GMV@ICG， 接着将DSPE ‑PEG2000‑N3与GMV@ICG混合搅拌形 成N3‑GMV@ICG， 最后离 心过滤。 2.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤1)的具体过程为： 首先将全脂 生羊奶脱脂去杂获得上清液， 然后加入凝乳酶去除酪 蛋白， 接着进 行超速离心和过滤， 最后 通过表面蛋白质进行定量， 并储 存。 3.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述脱脂去杂的过程采用的是差速超速 离心法： 首先将全脂羊奶样品在8000 ×g， 4℃， 30min的条件下离心获得上清液， 然后在 13200×g， 4℃， 1h的条件下进行二次离心。 4.如权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述凝乳酶的加入量为0.025g/L， 培养 温度为37℃， 培 养时间为6 h。 5.如权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 所述超速离心的条件为： 120000 ×g， 4 ℃， 90min； 所述过 滤的过程 为依次通过0.45 μm和0.2 2 μm的过滤器。 6.如权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤2)中使用的通透性增强剂为二 甲基亚砜； 使用的包封剂为在生理盐水中体积含量 为4％的二甲基亚砜。 7.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤2)中GMV@ICG的制备条件为： GMV与ICG 混合之后在黑暗、 4℃的条件下搅拌6 h。 8.如权利要 求7所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤2)中N3‑GMV@ICG的制备条件 为： DSPE‑PEG2000‑N3与GMV@ICG在37℃下持续反应3 0min。 9.一种权利要求1～8任一所述的制备 方法制备的诊疗性纳米探针。 10.权利要求9所述的诊疗性纳米探针在制备治疗肿瘤和减轻光热治疗后炎症药物/设 备中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114984214 A 2一种基于羊奶 源性细胞外囊泡的诊疗性纳米探针、 制备方 法 及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物与医药技术领域， 尤其涉及一种基于羊奶源性细胞外囊泡的诊疗 性纳米探针、 制备 方法及其应用。 背景技术 [0002]根据世界卫生组织的调查， 结肠癌患者的死亡率在所有癌症类型中排名第四， 对 人们的健康和安全构成巨大威胁。 目前， 结肠癌的治疗仍以手术、 化疗和放疗为主； 也采取 了综合治疗措施， 如手术结合 放疗和化疗， 但结肠癌 患者的生存率没有显著提高。 [0003]随着医学技术的不断进步， 新的抗肿瘤治疗方法正在开发中， 其中多模态成像引 导的光热疗法(PTT)因其精准的治疗方式和 较低的毒副作用， 在癌症治疗中有着较广阔的 应用前景。 PTT利用光敏纳米颗粒将光转化为热， 从而有效地杀死癌细胞。 各种具有优异光 热转换性能的纳米介质， 如金纳米颗粒、 碳纳米管、 氧化石墨烯纳米颗粒和黑磷纳米球， 已 广泛用于PTT， 但目前无机纳米的毒副作用仍不确定。 ICG是美国食品和药物管 理局(FDA)批 准的一种近红外荧光 染料(NIRF)， 具有良好的光热性能， 即可在激光辐射下， 诱导热疗效应 来破坏恶性组织。 因此， 基于ICG 的PTT可能是临床治疗恶性肿 瘤的有效方法。 然而， 由于光 热治疗诱发高温， PTT后最可能的细胞死亡模式是坏死， 其特征是质膜破裂， 细胞内容物释 放， 进而引发炎症。 虽然炎症是机体对外界刺激的一种常见防御反应， 但研究已证明， 治疗 诱导的炎症可导致严重的不良反应， 包括肿瘤再生、 转移 性播散和治疗抵抗。 此外， IC G亦具 备一些缺点， 例如其水稳定性低、 循环系统清除快， 以及缺乏肿瘤 靶向作用。 因此， 有效缓解 炎症反应， 提高ICG的特异性和利用率对肿瘤的PT T治疗具有重要意 义。 [0004]细胞外囊泡(EV)是由多种细胞分泌的膜状纳米颗粒， 主要包括外泌体、 微囊泡和 凋亡小体。 EV作为一种天然的生物纳米颗粒， 已被广泛用于递送多种药物到靶组织。 例如， 紫杉醇、 阿霉素、 姜黄素以及核酸等药物已有效地负载到EV中， 并递送到靶细胞， 发挥多种 治疗效能。 然而， 在这些研究中， EV多从细胞上清中分离出， 产量较低， 操作复杂且造价高。 这些缺点限制了 EV作为纳米载体在临床的实际应用。 因此发掘一种产量高的EV迫在眉睫。 发明内容 [0005]为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种基于羊奶源性细胞外囊泡GMV的诊疗 性纳米探针、 制备方法及其应用。 本发明证实GMV具有产量大、 大小合适、 稳定性好、 携带量 大、 无细胞毒性、 与肿瘤结合能力强等优点， 是一种理想的纳米药物 递送系统。 本发 明用GMV 负载ICG， 并将N3基团修饰到GMV表面， 成功 获得N3‑GMV@ICG纳米探针， 该纳米探针水合直径 约200nm， 稳定性高， 可通过肿 瘤的高通透性和滞留效应聚集于肿瘤位置。 该纳米探针与肿 瘤细胞有良好的结合能力， 可向肿瘤组织递送药物， 增加药物的递送效率。 且在激光辐照 下， 该纳米探针具备良好的肿瘤光热治疗效能， 此外， 由于 GMV固有的抗炎作用， 本发明的纳 米探针可减轻光热治疗后炎症反应， 降低肿瘤的复发及转移， 为肿瘤的光热治疗以及减轻说　明　书 1/7 页 3 CN 114984214 A 3