(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210615397.X (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 北京奇糖科技有限公司 地址 100700 北京市朝阳区广渠路3 3号院1 号楼10层A单 元1001室6 (72)发明人 孙忠杰　刘鹭　齐海龙　谢皇帆　 苏红　冯晶　李姝　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 温可睿 (51)Int.Cl. C12N 15/62(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12N 5/10(2006.01)A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用 (57)摘要 本发明涉及免疫治疗技术领域， 尤其涉及核 酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用。 本发明提 供的核酸片段能够用于构建肿瘤 疫苗， 其利用肿 瘤细胞过表达XCL1/CCL21/IL ‑7/IL‑12， 招募和 活化CD8α+DC和杀伤效应细胞， 达到增强肿瘤免 疫反应， 释放大量TAA， 活化多种TAA特异性的杀 伤细胞， 进 而抑制肿瘤生长发展的效果。 权利要求书1页 说明书11页 序列表9页 附图3页 CN 115433734 A 2022.12.06 CN 115433734 A 1.核酸片段， 其包括 IL‑12表达模块和I L‑7表达模块； 所述IL‑12表达模块包括： 编码C CL21的核酸和编码I L‑12的核酸； 所述IL‑7表达模块包括： 编码XCL1的核酸和编码I L‑7的核酸。 2.根据权利要求1所述的核酸片段， 其特征在于， 所述IL ‑12表达模块依次包括启动子 A、 编码CCL21的核酸、 编码自剪切2 A核糖体跳跃肽的核酸和编码I L‑12的核酸； 所述编码I L‑12的核酸包括： 编码I L‑12B的核酸、 l inker和编码I L‑12A的核酸。 3.根据权利要求1所述的核酸片段， 其特征在于， 所述IL ‑7表达模块依次包括： 启动子 B、 编码XCL1的核酸、 编码自剪切2 A核糖体跳跃肽的核酸和编码I L‑7的核酸。 4.根据权利要求1～3任一项所示的核酸片段， 其特征在于， 其包括顺序 连接的： 启动子 A、 编码CCL21的核酸、 编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸、 编码IL ‑12B的核酸、 linker、 编码 IL‑12A的核酸、 启动子B、 编码XCL1的核酸、 编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸、 编码IL ‑7的 核酸、 IRES 片段和报告基因。 5.根据权利要求 4所述的核酸片段， 其特 征在于， 所述启动子A和启动子B独立 地选自： SV40启动子、 包含增强子序列和内含子的EF1a哺乳动物启动子、 或包含增强子序列和内含子的C MV哺乳动物启动子 。 6.根据权利 要求4所述的核酸片段， 其特征在于， 所述linker编码的短肽的氨基酸序列 为VPGVGVPA VG。 7.根据权利要求 4所述的核酸片段， 其特 征在于， 所述报告基因为mRFP。 8.根据权利要求 4所述的核酸片段， 其特 征在于， 其核酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 9.重组载体， 其特 征在于， 包括权利要求1～8任一项所述的核酸片段和骨架载体。 10.根据权利要求9所述的重组载体， 其特征在于， 所述骨架载体上还包括EF1a   promotor、 IRES、 WPRE、 3 ’LTR、 3’LTR(ΔU)、 HIV ‑1Ψ、 RRE和cPPT/CTS元件。 11.根据权利要求9或10所述的重组载体， 其特征在于， 其核酸序列如SEQ  ID NO:2所 示。 12.慢病毒， 其特 征在于， 由权利要求9 ～11任一项所述重组载体转染细胞获得。 13.宿主， 其由权利要求12所述的慢病毒转染细胞获得。 14.根据权利要求13所述的宿主， 其特 征在于， 所述细胞为TC ‑1细胞。 15.如下I)～IV)中至少一项在制备肿瘤疫苗中的应用； I)、 权利要求1～8任一项所述的核酸片段； II)、 权利要求9 ～11任一项所述重组载体； III)、 权利要求12所述的慢病毒； IV)、 权利要求13或14所述的宿主。 16.肿瘤疫苗， 其特 征在于， 由权利要求13或14所述的宿主制得。 17.权利要求16所述肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 将所述宿主以丝裂霉素孵育 后， 经胰蛋白酶消化获得 所述肿瘤疫苗。 18.权利要求16所述的肿瘤疫苗在制备治疗肿瘤的药物中的应用。 19.根据权利要求18所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤包括宫颈癌、 黑色素瘤、 非小细 胞肺癌、 胆囊癌、 结肠直肠癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 肝癌、 肝癌转移或尤因氏肉瘤。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115433734 A 2核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及免疫治疗技术领域， 尤其涉及核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应 用。 背景技术 [0002]癌症是世界上最难治愈 的疾病之一。 传统的癌症治疗手段包括手术切除、 放疗和 化疗， 但并非适用于所有患者， 且疗效有限。 从20世纪初开始， 免疫治疗(immunotherapy)逐 渐成为新的肿瘤治疗手段， 包括异基因造血细胞移植、 过继细胞移植(包括T、 NK、 DC等细 胞)、 靶向单克隆抗体、 免疫检查点抑制和其他细胞疗法等。 尽管取得了一定疗效， 但靶向治 疗和免疫检查点抑制剂常常出现肿瘤耐受现象； 过继细胞移 植目前在实体瘤治疗中几乎无 效。 肿瘤治疗失败的原因主要在于肿瘤的异质性和肿瘤的免疫抑制性微环境。 药物治疗往 往会形成筛选压力， 使药物耐受的肿瘤细胞具备生存优势而造成肿瘤 复发和转移； 过继细 胞治疗使用的细胞很难进入肿瘤组织， 且肿瘤的免疫抑制性微环境常常使 杀伤性的细胞脱 敏而失去抗瘤效果。 因此， 肿瘤治疗仍需要开发新的策略。 为克服肿瘤细胞异质性， 可利用 肿瘤组织来源的肿瘤细胞作为疫苗， 为肿瘤治疗提供丰富的潜在的多种肿瘤相关抗原 (TAA)， 活化多种TA A特异性的T细胞， 从而实现肿瘤治疗的目的。 [0003]克服肿瘤组织的免疫细胞浸润困难和免疫抑制性微环境可以由趋化因子和免疫 活化细胞因子入手。 抗瘤免疫反应依赖于抗原提呈细胞(APC)和抗原特异性T细胞的活化。 外源性抗原只有被APC摄取、 加工， 才能有效地提呈至细胞表 面， 活化初始T细胞。 近年来， 大 量研究认为， 在小鼠体内， CD8α +DC是诱导CD8+T细胞活化最有效的APC， 可将抗原从肿瘤转 移到引流淋巴结(人体内对应的细胞为CD141+DC， 又称为BDCA3+DC)。 [0004]细胞因子中， 白细胞介素 ‑7(IL‑7)和白细胞介素 ‑12(IL‑12)在抗击肿瘤中具备重 要作用。 IL ‑7是IL‑2超家族成员之一， 通过与细胞表面具有一个共同γ链亚单位的受体结 合而发挥效应。 IL ‑7具备抗肿瘤免疫反应， 可诱导单核细胞产生IL ‑1α、 IL‑1β 和TNF‑α， 是增 加细胞毒性CD8+T淋巴细胞最有效的细胞因子。 IL ‑7治疗可增强长期肿瘤抗原特异性CD8+T 细胞反应。 IL ‑12由两个共价连接的p35和p40亚单位组成。 作为抗肿瘤免疫治疗最有效的药 物之一， IL ‑12的免疫调节和抗血管生成功能是其抗癌效用的基础。 IL ‑12可连接先天免疫 和适应性免疫， 通过促进NK细胞和T细胞的IFN ‑γ产生、 增殖和细胞裂解活性， 诱导细胞免 疫。 此外， IL ‑12通过IFN ‑γ和淋巴细胞 ‑内皮细胞相互作用诱导抗血管生成程序。 因此， 以 白细胞介素 ‑7(IL‑7)和白细胞介素 ‑12(IL‑12)制备具有抗肿瘤功能的疫苗具有良好的应 用前景。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的 应用。 [0006]本发明提供的核酸片段包括 IL‑12表达模块和I L‑7表达模块；说　明　书 1/11 页 3 CN 115433734 A 3