(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210619622.7 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 中国人民解 放军海军军医大学 地址 200433 上海市杨 浦区翔殷路80 0号 (72)发明人 蒋俊锋　王越　杨彦勇　陈媛媛　 张莉　高福　韩超峰　 (74)专利代理 机构 上海申浩 律师事务所 31280 专利代理师 赵青 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) A61K 45/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 通过基因编辑技术联合DNA损伤 修复抑制剂 特异杀伤癌细胞的方法 (57)摘要 癌症对人类健康有着巨大的威胁， 目前没有 特别好的治疗 方法。 最主要的原因是尚未找到非 常好的特异杀伤癌细胞而对正常细胞影响较小 的方法。 DNA的断裂如果得不到修复会导致细胞 死亡， 这是放疗的基本原理， 但放疗也会导致正 常细胞中的DNA损伤。 本发明提出一种特异杀伤 癌细胞的方法， 利用基因编辑技术造成癌细胞特 有的DNA断裂(正 常细胞中没有 这些DNA切点)， 同 时联合DNA损伤修复抑制剂， 抑制癌细胞中的DNA 修复， 导致癌细胞特异性死亡。 本发明为癌症的 精准治疗提供了新思路。 权利要求书1页 说明书12页 序列表6页 附图5页 CN 115227834 A 2022.10.25 CN 115227834 A 1.一种基因编辑系统和DNA损伤修复抑制剂联用 在制备治疗肿瘤药物中的应用， 所述 的基因编辑系统， 是针对癌细胞中特有的不同于正常细胞的DNA序列设计合成， 用以使癌细 胞中的特有DNA序列断裂或损伤。 2.根据权利要求1所述的基因编辑系统和DNA损伤修复抑制剂联用 在制备治疗肿瘤药 物中的应用， 所述的特有DNA序列为癌细胞中特有的且能和正常细胞区分的DNA序列包括但 不限于点 突变、 插入突变、 缺失突变、 染色体易 位。 3.根据权利要求1或2所述的基因编辑系统和DNA损伤修复抑制 剂联用在制备治疗肿瘤 药物中的应用， 所述的基因编辑系统为锌指核酸酶系统、 转录激活因子样效应子系统、 CRISPR基因编辑系统、 其 他能导致特异位 点DNA损伤的基因编辑系统。 4.根据权利要求3所述的基因编辑系统和DNA损伤修复抑制剂联用 在制备治疗肿瘤药 物中的应用， 所述的基因编辑系统是直接合成的， 或是导入细胞后能被细胞生成有效编辑 系统的载体。 5.根据权利要求1或2所述的基因编辑系统和DNA损伤修复抑制 剂联用在制备治疗肿瘤 药物中的应用， 所述的DNA损伤 修复抑制剂包括但不限于以下任一或两者组合： 非同源末端 连接途径的抑制剂、 同源重组途径的抑制剂。 6.根据权利要求1或2所述的基因编辑系统和DNA损伤修复抑制 剂联用在制备治疗肿瘤 药物中的应用， 所述的治疗肿瘤药物， 其给 药方式为注射、 口服、 外 涂、 吸入。 7.根据权利要求1或2所述的基因编辑系统和DNA损伤修复抑制 剂联用在制备治疗肿瘤 药物中的应用， 所述的肿瘤 包括但不限于肝癌、 胃癌、 肠癌、 前列腺癌、 乳 腺肿瘤、 头颈肿瘤、 胶质母细胞瘤、 膀胱肿 瘤、 胰腺肿瘤、 卵巢肿瘤、 皮肤肿 瘤、 白血病、 淋巴瘤， 骨肉瘤， 纤维肉 瘤。 8.一种通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞的方法， 包括以下 步骤： S1.确定癌细胞中特有的不同于正常细胞的至少一条DNA序列； S2.设计合成针对S1步骤确定的特有序列的基因编辑系统， 导入癌细胞使特有序列断 裂或损伤； S3.将DNA损伤修复抑制剂导入癌细胞。 9.根据权利要求8所述的通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞 的方法， 所述的S1步骤中， 特有的DNA序列为癌细胞中特有的且 能和正常细胞区分 的DNA序 列包括但不限于点 突变、 插入突变、 缺失突变、 染色体易 位。 10.根据权利要求8或9所述的通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌 细胞的方法， 所述的S2 步骤中， 基因编辑系统是锌指核酸酶系统、 转录激活因子样效应子系 统、 CRISPR基因编辑系统、 其 他能导致特异位 点DNA损伤的基因编辑系统。 11.根据权利要求8或9所述的通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌 细胞的方法， 所述的S 3步骤中， DNA损伤修复的抑制剂包括但 不限于选自以下任一或两者组 合： 非同源末端连接途径的抑制剂、 同源重组途径的抑制剂。 12.根据权利要求8或9所述的通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌 细胞的方法， 所述的S2和S3步骤中， 导入癌细胞可以是同步， 也可以是分别导入， 导入方法 可以相同或不同。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115227834 A 2通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞 的方法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术及癌症治疗领域， 具体涉及一种特异性强， 能有效应对癌细 胞演进性和异质性问题的癌细胞 特异性杀伤方法， 以及相应的产品和应用。 背景技术 [0002]癌症是严重威胁人类生命的疾病,目前肿瘤的主要依靠包括手术， 化疗和放射等 治疗方式治疗， 目前极少癌症患者能被完全治愈。 手术的方式不能把所有的癌细胞都去除， 而放疗和化疗等其它肿瘤治疗方法都不能特异的只杀伤癌细胞， 因此找到不杀伤正常细胞 只杀伤癌细胞的方法可能对于肿瘤的治疗有重要意 义。 [0003]最近出现的基因编辑技术使得人们可以对细胞内的DNA的精准位点进行切割， 突 变， 修改， 插入， 替换等编辑， 有广阔的应用前景。 现有的基因编辑技术包括： 锌指核酸酶 (ZFN)、 转录 激活因子样效应子(TALEN)和规 律成簇的间隔短回文重复(CRIS PR)等。 [0004]例如CRISPR基因编辑技术， 发现于细菌的免疫机制。 CRISPR(clustered   regularly  interspaced  short palindromic  repeats)是存在于细菌基因组中的DNA序 列， 即成簇规律间隔短回文重复。 有多种类型的CRISPR相关基因(CRISPR  associated， Cas)， Cas9是其中一种类型， 其表达产物是Cas9核酸内切酶。 以Cas9作为切割元件的CRISPR 基因编辑为例， 人们通过在细胞中导入Cas9和一条经过特殊设计的向导RNA(gRNA)实现快 速精准的对目标DNA的切割。 具体机制是gRNA通过碱基互补原理与目的DNA位点结合， 指导 Cas9蛋白定位于目的DNA位点， 并造成结合位置DNA在精准位点的断裂， 再利用细胞中本来 存在的DNA的损伤修复机制， 实现对DNA在断裂位点及附近进行突变， 插入， 替换等等修改， 实现基因编辑的目的。 发 明人也一直在研究CRISPR ‑Cas9基因编辑技术， 并在安全性方面对 改技术进行了优化， 并成功地在特定位点诱导染色体易位(参见专利文献： 刘厚奇、 蒋俊锋 等， 一种安全编码Cas9蛋 白的核酸分子及其表达载体， 专利号CN  201510092144.9， 授权公 告号CN104805099B； CRISPR ‑Cas9技术构建染色体易位干细胞及动物模型的方法专利号CN   201510075127.4， 授权公告号CN104726494B),我们 还发明了一种新的CRISPR方法， 通过非 同源DNA末端连接(NHEJ)插入终止子， 从而有效地敲除前列腺癌细胞中重要的LncRNA(参见 专利文献： 蒋俊锋等， 一种利用基因编辑技术敲入终止子实现可转录元件敲除的方法， 专利 申请号CN201811415619.3， 公开号CN111218479A)。 由于CRISPR系统对基因进行编辑的最关 键环节就是对目的DNA位点精准的切割， 因此CRISPR系统常被比作一把可定点切割DNA的 “魔剪”(参见文献:Mali,P.,Yang,L.,Esvelt,K.M.,Aach,J.,Guell,M.,DiCarlo,J.E., Norville,J.E.,and  Church,G.M.(2013).RNA ‑guided human genome engineering  via  Cas9.Science  339,823‑826)。 [0005]我们知道癌 症的放疗的基本原理是通过射线将D NA打断， 这些断裂的D NA不能被修 复时会激活包括凋 亡等多种死亡信号通路， 导致细胞死亡。 但由于放疗难以避免的也会造 成正常细胞的DNA损伤， 因此剂量和范围都受到严格控制， 不能完全清除癌细胞， 且副作用说　明　书 1/12 页 3 CN 115227834 A 3