(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210623630.9 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 云南省药物研究所 地址 650111 云南省昆明市西山区碧鸡镇 冷水塘24 号 (72)发明人 李小辉　陆礼和　冯莉萍　段有志　 李战国　陆雪萍　张天财　梅双喜　 杨增明　崔涛　孙敏　 (51)Int.Cl. C07C 231/24(2006.01) C07C 235/34(2006.01) A61P 9/12(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 31/00(2006.01) (54)发明名称 一种高纯度地骨皮乙素的制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种高纯度地骨皮乙素的制备 方法及应用， 属于中草药提取分离领域。 该方法 的具体步骤为： 将枸杞或宁夏枸杞植物粗粉碎 后， 水或低醇提取， 提取液依次进行大孔吸附树 脂、 凝胶和反相材料柱层析， 以乙醇/甲醇、 水、 酸 溶液为洗脱剂， 洗脱液经T LC、 HPLC分析检测后合 并溶剂， 溶剂回收， 干燥， 即得高纯度地骨皮乙 素。 本发明具有操作步骤易于重复、 条件易于控 制、 放大和溶剂易回收、 可反复使用， 对环 境污染 较小， 所得最终产物基本不含有机溶剂残留， 纯 度达到95%以上。 权利要求书1页 说明书5页 CN 114773218 A 2022.07.22 CN 114773218 A 1.一种高纯度地骨皮乙素的制备 方法， 其特 征在于以下步骤： 1） 枸杞或宁夏枸杞植物粗粉碎， 0%～50%乙醇溶液加热 回流提取， 料液比1∶5～1∶50， 提 取1～5次， 提取温度50℃～100℃， 每 次回流提取30min～300min， 提取液经过滤， 浓缩至料 液质量体积比1∶2 ～1∶ 15， 静置2 ～24h， 备用； 枸杞或宁夏枸杞植物粗粉碎， 0%～50%乙醇溶液渗漉提取， 料液比1∶5～ 1∶50， 提取温度 10℃～50℃， 提取 液经过滤， 浓缩至料液质量体积比1∶2 ～1∶ 15， 静置2 ～24h， 备用； 提取方式包括但不局限于如下 方法： 加热提取、 渗 漉、 冷浸、 超声、 微波提取； 2） 步骤1） 得到的上清液上大孔吸附树脂柱， 用1～5倍柱体积水洗脱， 主要除去极性较 大的多糖等 成分， 再用5%～30%乙醇洗脱， 收集醇洗脱液， 将5%～30%乙醇洗脱 液合并， 浓缩， 即得富含地骨皮乙素的粗 提取物； 3） 步骤2） 得到的粗提取物， 加0%～50%乙醇/甲醇溶液溶解后， 进行凝胶 材料柱层 析， 以 0%～50%乙醇/甲醇溶液洗脱进行凝胶柱层析， 薄层层析检测， 将含有地骨皮乙素成分洗脱 液合并， 浓 缩至近干； 4） 步骤3） 得到 的样品， 用0%～40%乙醇/ 甲醇溶液溶解后， 进行反相 材料柱层析， 先用0 ～10%酸性醇溶液洗脱， 除去极性较大的酰胺类生物碱， 再用10%～40%酸性醇溶液洗脱， 将 10%～40%酸性醇溶液洗脱液进行TLC/HPLC分析后合并， 回收溶剂至干， 即得地骨皮乙素粗 品； 5） 步骤4） 中得到的地骨皮乙素粗品， 加水溶解， 然后冷冻干燥后密封， 即得高纯度地骨 皮乙素。 2.根据权利要求1所述的一种高纯度地骨 皮乙素的制备方法， 其特征在于， 所述的枸杞 或宁夏枸杞植物为 地骨皮、 枸杞叶、 枸杞子、 枸杞根及枸杞全株植物中的一种或多种。 3.根据权利要求1所述的一种高纯度地骨皮乙素的制备方法， 其特征在于， 步骤2中所 述大孔吸附树脂为D ‑101、 HPD‑100、 HPD‑700、 ADS‑8、 HP‑20、 LSA‑20。 4.根据权利要求1所述的一种高纯度地骨 皮乙素的制备方法， 其特征在于， 步骤3） 中所 述凝胶材 料为LH‑20， G‑25， G‑250。 5.根据权利要求1所述的一种高纯度地骨 皮乙素的制备方法， 其特征在于， 步骤3） 中薄 层层析检测： 采用硅胶G板、 GF254板， 分别取凝胶柱不同洗脱段样 品和地骨皮乙素对照品溶 液各点样2～10 μl， 以乙酸乙酯 ‑甲酸‑乙酸‑水/乙酸乙酯 ‑甲酸‑水/乙酸乙酯 ‑乙酸‑水为展 开剂， 以碘/碘 化铋钾/碘 ‑碘化钾为显色剂， 进行显色， 日光下检视 。 6.根据权利要求1所述的一种高纯度地骨 皮乙素的制备方法， 其特征在于， 步骤4） 中所 述反相柱使用反相材 料为C8、 C18、 RP18或ODS。 7.根据权利要求1所述的一种高纯度地骨 皮乙素的制备方法， 其特征在于， 步骤4） 中所 述酸性醇溶液为0.05～5%的甲酸、 乙酸、 盐酸、 三氟乙酸 等酸的醇溶 液。 8.根据权利要求1所述的一种高纯度地骨 皮乙素的制备方法， 其特征在于， 步骤4） 中所 述醇溶液为碳链长度在6以下 的能够与水溶液互溶的低级醇溶液， 优选甲醇、 乙醇、 丙醇或 异丙醇。 9.根据权利要求1或2所述的一种高纯度地骨皮乙素的制备方法， 其特征在于， 地骨皮 乙素在制备治疗降压、 抗肿瘤、 降糖、 神经 元保护和修复、 治疗脓毒症药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114773218 A 2一种高纯度地骨 皮乙素的制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种从枸杞或宁夏枸杞植物中提取、 制备高纯度地骨皮乙素的方法。 背景技术 [0002]枸杞或宁夏枸杞为枸杞属植物， 全世界约80种， 主要分布在南美洲， 少数种类分布 于亚欧大陆温带， 我国产7种3变种， 主要分布于北部。 地骨皮是我国常用的传统中药， 被历 年版中国药典收载， 《中国药典》 2020版收载地骨皮为茄科植物枸杞Lycium  chinense   Mill.或宁夏枸杞Lycum  barbarum  L.的干燥根皮。 春初或秋后采挖根部， 洗净， 剥取根皮， 晒干。 地骨皮性甘、 寒， 归肺、 肝、 肾经。 功效： 凉血除蒸， 清肺降火， 用于阴虚潮热， 骨 蒸盗汗， 肺热咳嗽， 咯血， 衄 血， 内热消渴。 现代研究表明地骨皮具有降血压、 降血脂、 降血糖、 抑菌抗 炎、 免疫调节、 解热镇痛等药理 活性。 [0003]枸杞植物中主要含有生物碱， 目前已报道的近100个， 根据结构类型主要 分为酰胺 类、 环肽类、 哌啶类、 莨菪烷型、 去甲基莨菪烷型、 环戊烷并吡咯烷型等生物碱， 酰胺类中地 骨皮乙素占大部分。 地骨皮乙素具有较强的药理和生理活性， 具有降压、 降糖、 抗肿瘤、 抗 菌、 神经元保护和修复、 抗氧化、 治疗脓毒症 等功效。 近年来， 许多 学者对地骨皮乙素的药 理 活性和临床 应用进行深入而广泛的研究， 为地骨皮乙素的综合开 发和利用开辟更广阔的前 景， 但由于制备 条件的限制， 影响了地骨皮乙素的综合 开发和利用。 [0004]地骨皮乙素为粉末， 溶于甲醇、 乙醇、 水等溶剂， 极易吸潮为油状， 是地骨皮中主要 有效成分之一， 也是地骨皮药材和含地骨皮药材制剂质量控制的有效成分之一(香港中药 材标准)， 具有较好的降压、 抗肿瘤、 降糖、 神经元保护和修复、 治疗脓毒症和具有PD ‑1/PD‑ L1抑制等功效。 [0005]文献检索， 地骨皮乙素主要从地骨皮药材化中分离得到。 Funayama  S， 等人 (Kukoamine B， a  spermine  alkaloid  from Lycium chinense[J].Phytochemistry， 1995， 38(6)∶1529 ‑1564.)、 赵庆春等人(地骨皮醇提物、 地骨皮甲素及乙素具有神经保护作用的 药物中的用途[P]， 中国专利， CN103735728， 2016， 08.)、 郑江等人(苦柯胺A和苦柯胺B的用 途[P].中国专利，  CN101829075， 2010， 09.)、 张汉扬等人(苦柯胺分离方法[P]， 中国专利， CN104418761A，  2015， 03.)、 张金芳等人(一种地骨皮乙素的制备方法[P]， 中国专利， CN103435512， 2013，  12.)， 主要采用甲醇、 乙醇或酸水等溶剂提取， 正丁醇萃取富集， 并进 行离子交换树脂柱、 聚酰胺柱、 硅胶柱、 反相材料柱层析或通过半制备液相、 高速逆流等方 法， 以氯仿、 甲醇或乙腈等溶剂为洗脱剂， 进 行实验室级别样品的制备， 存在纯度低， 回收率 低， 能耗大， 无法进行规模化制备， 且易存在有机溶剂残留， 对环境污染严重等 缺点。 发明内容 [0006]本发明在于提供一种从富含地骨皮乙素(地骨皮乙素含量大于0.01％)的枸杞或 宁夏枸杞植物中提取制备地骨皮 乙素的方法及应用。 采用本发明制备地骨皮 乙素， 工艺简 便可行， 适用于工业化大生产， 毒性小， 且所用溶剂易回收、 可反复使用， 对环境污染较小，说　明　书 1/5 页 3 CN 114773218 A 3