ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广 东 省 地 方 标 准 DB44/T 2338—2021 实验动物 病原核酸液相芯片法定性分析 Laboratory animals Qualitative analysis of pathogen nucleic acids with suspension array method 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市场监督管理局 发 布 DB44/T 2338—2021 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 原理 ............................................................................... 2 6 主要设备和材料 ..................................................................... 2 7 试剂 ............................................................................... 2 8 方法 ............................................................................... 3 9 结果 ............................................................................... 6 10 防止交叉污染的措施 ................................................................ 7 附录 A（规范性） 溶液的配制 ........................................................... 8 附录 B（资料性） 实验动物病原液相基因芯片引物 ......................................... 9 I DB44/T 2338—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。 本文件由广东省实验动物标准化技术委员会（GD/TC 93）归口。 本文件起草单位：广东省实验动物监测所。 本文件主要起草人：黄韧、袁文、王静、徐凤姣、朱余军，伍妙梨、黄碧洪、罗银珠、何丽芳、闵 凡贵、丛峰、张钰、郭鹏举。 II DB44/T 2338—2021 实验动物 病原核酸液相芯片法定性分析 1 范围 本文件规定了实验动物病原核酸的液相芯片定性分析方法。 本文件适用于基于液相芯片方法的实验动物病原核酸的定性分析。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 液相芯片技术 suspension array technology 液相芯片技术又被称为悬浮阵列、流式荧光术、xMAP技术等。它是在不同荧光编码的微球上进行抗 原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别识别微球编码和 报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯 片、蛋白芯片之后的新一代高通量多分子分析技术平台。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 cDNA 互补 DNA（complementary DNA） CPE 细胞病变效应（cytopathic effect） DEPC 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate） DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） MFI 中位荧光强度值（median fluorescence intensity） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline） PCR 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction） RNA 核糖核酸（ribonucleic acid） SA-PE 链霉亲和素-藻红蛋白（streptavidin R-phycoerythrin） xMAP 多分子分析技术（flexible multi-analyte profiling technology） 1 DB44/T 2338—2021 5 原理 本文件方法的核酸扩增原理是基于每种病原微生物都可通过特异性的PCR引物来进行核酸扩增，在 每种特定目的片段的扩增引物5′端与对应的标签（TAG）序列的3′端通过间臂连接，另一条原始引物 的5′端添加生物素标记；这样所扩增的基因片段既带有TAG标签，也带有生物素标记，以供后期的液相 芯片特异性识别目标分子。 本文件方法的液相芯片检测原理是采用2种荧光染料对直径约为5.6 µmol/L带磁性聚苯乙烯小球 （以下简称微球）进行着色，通过不同混合比例产生100种不同配比的颜色，每一种颜色赋予唯一编码， 通过编码识别染色的微球。这些荧光微球表面带有羧基基团（如羧基、亲和素和组氨酸等）可共键结合 （或称偶联）不同类型的探针（如抗原、抗体、寡核苷酸探针等），形成带标记的荧光微球。待测样本 （如蛋白、核酸等）以生物素标记，再与结合了探针的荧光微球进行特异性结合反应，生物素标记与添 加到反应体系中的以PE荧光染料标记的链霉亲和素（Streptavidin）或称SA-PE发生连接可实现荧光信 号的放大。因此，整个反应结束后形成的阳性复合物可检测到微球的荧光和SA-PE的荧光信号。液相芯 片检测仪工作时，上述复合物在液流系统中快速通过，第一束红色激光识别微球染料和编码，第二束绿 色激光读取SA-PE荧光信号的强弱，仪器将获取到的两种光信号进行快速处理并形成数字信号，经软件 分析后计算得到每一种待测样本的含量。因此，液相芯片技术是集流式细胞技术、荧光标记微球、激光、 数字信号处理和传统的生化技术于一体，可以实现快速高通量多分子定性及定量分析的技术。 6 主要设备和材料 液相芯片检测仪。 PCR 仪。 全自动核酸提取仪。 超声波仪。 高速冷冻离心机。 普通离心机。 漩涡振荡器。 组织匀浆器。 生物安全柜。 PCR 超净工作台。 冰箱（-20 ℃）。 微量移液器（0.1 µL～2 µL，1 µL～10 µL，10 µL～100 µL，100 µL～1000 µL）。 灭菌离心管（1.5 mL、2 mL、5 mL、15 mL），灭菌吸头（10 µL，200 µL，1 mL），灭菌 PCR 扩 增反应管（0.2 mL，八连管或 96 孔板）。聚乙烯薄膜袋：90 mm×150 mm 自封袋，使用前紫外灭菌 20 min。 采样工具：剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。 7 试剂 以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，实验用水为双蒸水或去离子水，应符合 GB/T 6682 所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为无 DNA 酶、无 RNA 酶水。 2 DB44/T 2338—2021 7 表面带有羧基的特定编码微球（浓度为 1.25×10 beads/mL）。 灭菌 PBS。配制方法见附录 A。 PCR 用水：经 DEPC 处理的水或商品无 DNA 酶、无 RNA 酶水，见附录 A。 核酸抽提试剂：推荐针对不同的样本基质类型和不同病原微生物的核酸类型选取不同的基 因组提取试剂盒。 反转录试剂：PrimeScript RT reagent Kit 或其他类似产品。 注： PrimeScript RT reagent Kit 是本文件中适合的市售产品的使用实例，给出这一信息是为了方便本文件使用 者，并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似试剂。 PCR 试剂：QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit 或其他类似产品。 注： QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit是本文件中适合的市售产品的使用实例，给出这一信息是为了方便本文件使 用者，并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似试剂。 SA-PE 反应液（1 mg/mL）。 1×TM 杂交缓冲液，配制见附录 A。 引物：各病原微生物特异性正向引物的 5′端与对应的 TAG 序列的 3′端通过间臂（Spacer）连 接修饰，特异性反向引物 5′端标记生物素（biotin），所有的引物合成后均需要进行色谱级（HPLC） 纯化。 8 方法 生物安全措施 对于可能潜在人兽共患病的样本，应在生物安全二级及以上实验室进行操作，采样应在生物安全柜 中进行。采样结束，动物尸体及采样器材应高压灭菌后处理。实验操作及处理按照GB 19489的规定，由 具备相关资质的工作人员进行相应操作。 采样及样本的处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴一次性手套。采样及样本处理过程操 作人员应做好个人防护。 8.2.1 脏器组织 剖检，无菌采集动物脏器组织，剪取待检样本0.5 g～2.0 g于无菌离心管，加入5倍体积灭菌PBS， 使用匀浆器充分匀浆1 min～2 min，然后将组织悬液在4 ℃，5