ICS 65.020.30 CCS B 44 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2852—2021 普通级实验用猫 微生物学监测 Conventional experimental cat—Pathogenic surveillance 2021 - 11 - 08 发布 四川省市场监督管理局 2022 - 01 - 01 实施 发 布 DB51/T 2852—2021 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 检测要求 ........................................................................... 1 5 检测程序 ........................................................................... 2 6 检测方法 ........................................................................... 3 7 检测规则 ........................................................................... 4 8 结果判定 ........................................................................... 5 9 检测结论 ........................................................................... 5 附录 A （规范性） 猫泛白细胞减少症病毒 PCR 检测方法 .................................... 6 附录 B （规范性） 猫疱疹病毒 I 型 PCR 检测方法 .......................................... 8 附录 C （规范性） 猫杯状病毒 RT-PCR 检测方法 .......................................... 10 附录 D （规范性） 猫狂犬病病毒巢式 RT-PCR 检测方法 .................................... 12 附录 E （规范性） 猫白血病病毒巢式 RT-PCR 检测方法 .................................... 14 附录 F （规范性） 沙门氏菌荧光定量 PCR 检测方法 ....................................... 16 附录 G （规范性） 皮肤病原真菌多重 PCR 检测方法 ....................................... 17 附录 H （规范性） 猫传染性腹膜炎病毒 RT-PCR 检测方法 .................................. 18 I DB51/T 2852—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由四川省科学技术厅提出、归口并解释。 本文件起草单位：四川省农村科技发展中心、四川农业大学、四川省药品检验研究院。 本文件主要起草人：周紫峣、陈兵、邹弈星、王敬东、姚凌云、彭广能、荣祖元、黎家敏。 本文件首次发布。 II DB51/T 2852—2021 普通级实验用猫 微生物学监测 1 范围 本文件规定了普通级实验用猫微生物学监测的检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判 定和检测结论的要求。 本文件适用于普通级实验用猫的微生物学监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 14926.50 实验动物 酶联免疫吸附试验 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 NY/T 564 猪巴氏杆菌病诊断技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 实验用猫 experimental cat 经人工饲育，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检验 检测以及其他科学实验的猫。 普通级实验用猫 conventional experimental cat 不携带所规定的重要人兽共患病病原和猫烈性传染病病原的实验用猫。 4 检测要求 临床观察 普通级实验用猫临床观察应符合下列要求： ——被毛整齐平整不粗乱； ——头、尾、躯干、四肢正常无缺损； ——眼、鼻、口、耳、肛门、泌尿生殖器开口清洁，没有异常分泌物； ——行走正常； ——粘膜颜色正常。 1 DB51/T 2852—2021 检测项目 普通级实验用猫微生物检测项目应符合表1的规定。 表1 普通级实验用猫微生物检测项目 微生物 检测要求 猫泛白细胞减少症病毒 ▲ 猫疱疹病毒I型 ▲ 猫杯状病毒 ▲ 猫狂犬病病毒 ▲ 猫白血病病毒 ● 沙门氏菌 ● 皮肤病原真菌 ○ 猫传染性腹膜炎病毒 ○ 多杀巴斯德杆菌 ○ 注1：▲必检项目，指在进行实验用猫质量评价时应检测的项目，可以免疫。 注2：●必检项目，指在进行实验用猫质量评价时应检测的项目，要求阴性。 注3：○必要时检测项目，指申请生产许可证、引进实验用猫或怀疑本病流行等必要时要求检测的项目。 5 检测程序 普通级实验用猫检测程序应符合图1的要求。 2 DB51/T 2852—2021 a 检测结果存疑，需要进一步确诊时，应结合临床症状和前期检测结果，按照表2中检测方法的要求采集动物组织 或特定样本进行进一步检测。 图1 检测程序 6 检测方法 普通级实验用猫微生物检测方法应符合表2的要求。 表2 普通级实验用猫微生物检测方法 微生物 猫泛白细胞减少症病毒 猫疱疹病毒I型 检测方法 适用范围 GB/T 14926.50 抗体检测 应符合附录A的规定 核酸检测 GB/T 14926.50 抗体检测 应符合附录B的规定 核酸检测 3 DB51/T 2852—2021 表2 普通级实验用猫微生物检测方法（续） 微生物 检测方法 适用范围 GB/T 14926.50 抗体检测 应符合附录C的规定 核酸检测 GB/T 14926.50 抗体检测 应符合附录D的规定 核酸检测 猫白血病病毒 应符合附录E的规定 核酸检测 沙门氏菌 应符合附录F的规定 核酸检测 皮肤病原真菌 应符合附录G的规定 核酸检测 猫传染性腹膜炎病毒 应符合附录H的规定 核酸检测 多杀巴斯德杆菌 NY/T 564 核酸检测 猫杯状病毒 猫狂犬病病毒 注： 猫泛白细胞减少症病毒、猫疱疹病毒I型、猫杯状病毒、猫狂犬病病毒为免疫要求项目，应按照本标准中“抗 体检测”要求，检测70%以上的抗体合格率，在发现疑似症状时应使用本标准中“核酸检测”要求，判定阴性 以排除。 7 检测规则 检测频率 每6个月应至少检测1次。 采样 7.2.1 方式及数量 7.2.1.1 应选择 6 月龄以上实验用猫随机抽样。 7.2.1.2 普通级实验用猫抽样数量应符合表的 2 要求。 表3 普通级实验用猫采样数量 单位：只 群体数量 a a 采样数量 ≤100 应不少于10 100～500 应不少于20 ≥500 应不少于30 群体数量低于 10 只时，应全部采样 7.2.2 方法 7.2.2.1 可按微生物、寄生虫采样要求联合采样。 7.2.2.2 采样方法按照 NY/T 541 进行。 7.2.3 送检要求 4 DB51/T 2852—2021 样本应有明显标识，写明样品名称、品种、品系、等级、数量及检测项目等内容，由专人按照生物 样本包装和运输方式送达实验室。 8 结果判定 抗体检查 免疫项目，免疫密度应达到100%，免疫抗体合格率≥70%，判为合格。 非免疫项目，血清抗体阴性，判为合格。 抗原和核酸检查 未见阳性结果，判为合格。 9 检测结论 上述各项指标均合格，应判定为实验用猫符合普通级标准要求；有任一指标不合格，应判定实验用 猫不符合普通级标准要求。 5 DB51/T 2852—2021 A A 附 录 A （规范性） 猫泛白细胞减少症病毒 PCR 检测方法 A.1 待测样本 DNA 的提取与保存 将样本按照DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA，冻存于-70℃冰箱备用。 A.2 PCR 反应引物 根据vp2基因序列设计 上游引物序列（5′-3′）：CTGCTACTCAGCCACCAACT 下游引物序列（5′-3′）：TGGTGGTAAGCCCAATGCTC A.3 对照设立 从样品处理开始应设置阳性对照、阴性对照。 阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原体或质粒添加到已知阴性样 品中作为阳性对照样品。 阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。 空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为空白对照。 A.4 PCR 反应体系及条件 A.4.1 PCR反应体系 2+ 20µL体系包括10×PCR buffer（含Mg ）2µL，dNTP（2.5mM）1.6µL，上下游引物（10µM）各1µL， Taq酶（5U/µL）0.5µL，模板DNA 2µL，最后用灭菌双蒸水补齐。 A.4.2 PCR反应条件 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72