ICS 11.220 CCS B 41 37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4460—2021 规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性 腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧 光定量 RT-PCR/PCR 检测技术规程 Real-time fluorescence quantitative RT-PCR/PCR detection technique for foot-and-mouth disease virus, bovine viral diarrhea virus and infectious bovine rhinotracheitis virus in aerosol of large-scale cattle farms 2021-12-27 发布 2022-01-27 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 4460—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 I DB37/T 4460—2021 规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻 气管炎病毒实时荧光定量 RT-PCR/PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒荧光定 量RT-PCR/PCR检测技术。 本文件适用于畜舍环境及疫区环境气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病 毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 FMD：口蹄疫 FMDV：口蹄疫病毒 BVDV：牛病毒性腹泻病毒 IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒 PCR：聚合酶链式反应 RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应 DNA：脱氧核糖核酸 RNA：核糖核酸 cDNA：与信使RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA AGI：全玻璃液体冲击式采样器 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水 5 试剂或材料 1 DB37/T 4460—2021 5.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 要求。所用液体试剂均需 使用无 DNA/RNAase 的容器进行分装。 5.2 体积比 25:24 的酚：氯仿溶液，应 2 ℃～8 ℃保存见 A.1。 5.3 体积比 24:1 的氯仿：异戊醇溶液，应 2 ℃～8 ℃保存见 A.2。 5.4 0.1 % DEPC 水。 5.5 无水乙醇，应-20 ℃预冷。 5.6 75 % 乙醇，配置见 A.5，应-20 ℃预冷。 5.7 TE 缓冲液，配制见 A.6。 5.8 2 mol/L NaAc 溶液，配制见 A.7。 5.9 阳性、阴性对照。 ——阳性对照：分别为带有 FMDV 5′-UTR 基因、BVDV 5′-UTR 基因和 IBRV gD 基因的质粒，制备见附 录 B。 ——阴性对照：分别为已知 FMDV、BVDV 阴性气溶胶样本的 cDNA 和 IBRV 阴性气溶胶样本 DNA。 6 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 空气微生物采样箱。 荧光 PCR 检测仪及配套反应管（板）。 高速冷冻离心机，最高转速应不低于 13 000 r/min。 冰箱，2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种。 微量移液器及配套吸头，量程规格应包含 5 L、10 L、100 L 和 1 000 L。 1.5 mL 离心管，应无 DNAase 和 RNAase。 电热恒温水槽（室温至 100 ℃）。 涡旋振荡器。 天平（精密度千分之一以上）。 Ⅱ级生物安全柜 A 型。 7 气溶胶样品 7.1 气溶胶样品的采集、灭活处理 应用空气微生物采样箱，使用国际标准的AGI采集样本。样品采集后立即用1 %甲醛溶液灭活处理。 采集方法与注意事项应按照附录C。 7.2 样品贮运 样品采集后，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个自封袋），于保温箱中加冰、密封， 24 h内送实验室。 7.3 样品保存 样品在2 ℃～8 ℃条件下保存不应超过24 h，若长期保存应置-70 ℃以下，应避免反复冻融（冻融不 超过三次）。 8 实验步骤 2 DB37/T 4460—2021 8.1 实验室规范 荧光RT-PCR检测方法的实验室规范应符合GB 19489和GB/T 27401要求，整个实验过程中均须使用无 DNAase/RNAase的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须250 ℃干烤4 h以上，以彻底去除DNAase/RNAase。 8.2 样品病毒核酸 RNA 和 DNA 提取 所提取物为气溶胶采集液，可能含有病毒。操作者必须带口罩和一次性手套，RNA提取尽量在人少 时进行，防止空气中RNAase的污染。所用物品也应无RNAase。 8.2.1 样品病毒核酸 RNA 提取 8.2.1.1 在 1.5 mL 的离心管中加入样品上清液 200 μL，再加入 TRIzol 1 mL，充分混匀，室温放置 10 min。 8.2.1.2 加入 200 μL 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相 现象），室温放置 10 min。 8.2.1.3 4 ℃离心、13 000 r/min、15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 8.2.1.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 8.2.1.5 离心 4 ℃、13 000 r/min、15 min，用枪小心吸去所有上清。 8.2.1.6 加 1 mL 75 %乙醇洗一遍，离心 4 ℃、8 000 r/min、10 min，用枪小心吸去所有上清，重复此 步骤，在超净台中干燥 5 min。 8.2.1.7 加入 50 μL TE 缓冲液溶解 RNA，-20 ℃保存备用。 8.2.1.8 可采用经验证的病毒 RNA 提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 RNA。 8.2.2 样品病毒核酸 DNA 提取 8.2.2.1 在 1.5 mL 的离心管中加入样品上清液 200 μL，加入 450 μL 裂解缓冲液，再加入 20 μL 蛋 白酶 K，充分混匀，55 ℃ 15 min。 8.2.2.2 加入 700 μL 的酚：氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无 分相现象），室温放置 10 min。 8.2.2.3 13 000 r/min、15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 8.2.2.4 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 8.2.2.5 13 000 r/min、15 min，取上清液相移入另一管。 8.2.2.6 加入 1/10 体积 2 mol/L NaAc 和等体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室 温放置 10 min。 8.2.2.7 13 000 r/min、5 min，用枪小心吸去上清，加 1 mL 75 %乙醇洗一遍，8 000 r/min、10 min， 用枪小心吸去所有上清，重复此步骤，在超净台中干燥 5 min。 8.2.2.8 加入 50 μL TE 缓冲液溶解 DNA，-20 ℃保存备用。 8.2.2.9 可采用经验证的病毒核酸提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 DNA。 8.3 实时荧光定量 RT-PCR/PCR 扩增 8.3.1 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。设所需PCR管数为n（n=样本数+1管阴性对照+2管阳性对照），每个测试 反应体系需要20 μL荧光RT-PCR反应液。根据所检测的病毒选择引物，见表D.1。按D.2配制反应液，为 避免移液器取样损失，建议按n+1个反应配制，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分 混合均匀后，向每个PCR管中各分装20 μL，转移至样品处理区。 3 DB37/T 4460—2021 8.3.2 加样 在样品处理区进行。分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤7.2.1.7中制备的RNA溶液5 μL和 7.2.2.8中制备的DNA溶液2 μL，盖紧管盖，500 r/min 离心30 sec，转移至检测区。 8.3.3 实时荧光定量 RT-PCR 反应 在检测区进行，选择检测模式：SYBR Green I。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。 反应参数设置：第一阶段，反转录42 ℃/15 min；第二阶段，预变性95 ℃/30 sec；第三阶段，94 ℃/15 sec，61 ℃/30 sec，40个循环。最后40 ℃ 2 min。荧光收集在第三阶段每次循环的61 ℃延伸时进行。 可根据不同品牌PCR仪器说明书等效设置参数。 8.3.4 实时荧光定量 PCR 反应 在检测区进行，选择检测模式：SYBR Green I。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。 反应参数设置：第一阶段，预变性94 ℃/3 min；第二阶段，94 ℃/15 sec，61 ℃/30 sec，40个循环。最 后40 ℃ 2 min。荧光收集在第二阶段每次循环的61 ℃延伸时进行。可根据不同品牌PCR仪器说明书等效 设置参数。 9 结果判定 9.1 结果分析条件的设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点为 准。 9.2 质控标准 9.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 9.2.2 阳性对照的 Ct 值应小于等于 28，并出现典型的扩增曲线。 9.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 9.3 结果判定 9.3.1 阴性 检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无FMDV、BVDV、IBRV核酸。 9.3.2 阳性 若检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤30.0，表示相应管内样本中分别存在FMDV、BVDV、IBRV 核酸。 9.3.3 可疑 若检测通道Ct值在30.0～38.0区间，且出现典型的扩增曲线的样品，建议复验。复验仍出现上述结