ICS 67.040 B 30 江 DB36 西 省 地 方 标 准 DB36/T 1370—2020 番茄绵疫病菌抗药性检测技术规程 Technical rules for detecting fungicide resistance in Phytophthora capsici on tomato 2020 - 12 - 29 发布 江西省市场监督管理局 2021 - 07 - 01 实施 发 布 DB36/T 1370—2020 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 测定方法 .......................................................................... 2 5 数据统计和分析 .................................................................... 3 6 检测报告的形成及归档 .............................................................. 5 附录 A（资料性） 辣椒疫霉菌菌落培养特征及孢子囊形态特征 .............................. 6 I DB36/T 1370—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所。 本文件主要起草人：何烈干、邹芬、马辉刚、周云峰、涂玉琴、王美清、王修慧、朱跃冬、朱业斌、 赖金美。 II DB36/T 1370—2020 番茄绵疫病菌抗药性检测技术规程 1 范围 本文件规定了番茄绵疫病菌抗药性检测的术语和定义及检测方法。 本文件适用于番茄绵疫病菌对杀菌剂的抗性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 12475 农药贮运、销售和使用的防毒规程 NY 608 农药产品标签通则 NY/T 1276 农药安全使用规范 总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 抗药性 fungicide resistance 有害生物群体对农药产生敏感性下降的遗传变化。 3.2 抑制中浓度（EC50） median effective concentration（EC50） 在试验时间内，抑制50%菌丝生长或孢子萌发所需的药剂有效浓度。 3.3 番茄绵疫病 tomato brown rot 由疫霉属辣椒疫霉Phytophthora capsici Leonian侵染番茄引起的一种流行性病害。主要为害果实， 在近地面未成熟的果实肩部或顶部出现表面光滑的淡褐色斑，有时生少许白霉，后逐渐形成同心轮纹斑， 深褐色。病果不软化，易脱落。 3.4 敏感基线 sensitivity baseline 1 DB36/T 1370—2020 在同类作用方式的杀菌剂使用之前，靶标病菌群体中不同菌株对一种药剂的敏感性(EC50值)分布曲 线，常用平均值及95%置信限表示。 3.5 人工接种 artificial inoculation 在适宜条件下，通过人工操作将菌饼置于含药的平板中央，通过菌丝生长速率来检测病菌的抗药性 水平。 4 测定方法 4.1 样品的采集、分离、鉴定和保存 4.1.1 菌株的采集 在田间选择刚发病的番茄叶片，装入一次性小塑料袋内，置于冰块中，一天内带回实验室进行分离。 4.1.2 病原菌的分离 将采回的病叶用自来水和灭菌水冲洗干净，凉干后，背面朝上置于灭菌过的2%琼脂培养基上，25 ℃ 培养箱内光暗交替（12 h/12 h）保湿培养4 d～5 d，发病后挑取霉层置于选择性培养基上，25 ℃培养 8 d～10 d(菌落直径长至2 cm～3 cm)。 4.1.3 绵疫病菌的鉴定 挑取少量分离纯化的菌丝制成玻片，在100倍显微下观察菌体形态。当菌体形态与附录A相符时，则 确定所分离的病菌为辣椒疫霉。 4.1.4 病原菌的保存 挑取分离出来的辣椒疫霉少量菌丝置于选择性培养基上，在培养箱中25 ℃黑暗培养3 d，再将菌落 边缘单菌丝的尖端连同培养基一起切下，置于斜面基础培养基上，25 ℃黑暗培养14 d后，加入灭菌过 的石蜡油（液面超过菌面约1 cm），10 ℃黑暗保存，备用，每半年转接1次。 4.2 培养基的制备 4.2.1 黑麦培养基 称取50g黑麦，在蒸馏水中浸泡24h，在121 ℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌30 min，取出用双层纱布过滤 去渣，上清液补足水至1000 mL，加入琼脂20 g，用玻棒搅匀，经三角瓶分装好后在121 ℃下高压蒸汽 灭菌20 min。 4.2.2 选择性培养基 -1 -1 待黑麦培养基冷却至50℃～60℃时，加入利福平20 mg．L ，氨苄青霉素200 mg．L ，70%五氯硝 -1 基苯100 mg．L ，充分摇匀后倒入培养皿中。 4.3 菌丝生长速率法 2 DB36/T 1370—2020 将能明显抑制菌丝生长的供试药剂（烯酰吗啉、霜脲氰、嘧菌酯、氟吗啉、霜霉威、精甲霜灵、百 菌清等及其混剂）与培养基混合，以菌丝生长速率快慢来检测番茄绵疫病菌对药剂的抗性水平。试验时， -1 -1 -1 -1 先进行预备测定，将各待测菌株移入含上述杀菌剂0.1 μg·mL 、1.0 μg·mL 、10.0 μg·mL 、100.0 μg·mL 的培养基平板中25 ℃培养7 d，根据其生长情况设计正式测定时的杀菌剂系列浓度梯度。 4.4 含药培养基的制作 收集杀菌剂原药，保存于避光、低温（0 ℃～4 ℃）及干燥条件下。 4 -1 原药溶于相应的有机溶剂中，配置成10 μg·mL 母液，按照4.1的测定结果用无菌水稀释配置成不同 浓度梯度的含药培养基，一般每种药剂应设置6个梯度浓度，以仅加入等量有机溶剂的平板为对照。 4.5 接种及培养 将保存的菌株取出活化，将菌株在黑麦培养基上25 ℃培养5 d，用直径为6 mm的打孔器在菌落边缘 同一圆周上打取菌饼，将菌饼菌面朝下分别接在含系列浓度药剂的黑麦培养基平板中央，设3个重复， 以不加药剂为对照，于25℃黑暗培养6 d后，当对照（不含药）组菌落直径达到7 cm～8 cm时，用垂直 十字交叉法测量各处理的菌落直径。 5 数据统计和分析 5.1 毒力回归方程的建立 用十字交叉法测量菌落直径的平均值(mm)，按依以下公式算出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率 （%），抑制率（P）（%）=［（对照菌落增长直径-处理菌落增长直径）/对照菌落增长直径］×100%。 将菌丝生长抑制率换算成抑制效果机率值(Y) , 药剂浓度换算成浓度对数(X)。采用SPSS、DPS 等 统计软件求出毒力回归方程Y=a+bX，并计算有效抑制中浓度（EC50）、置信区间和相关系数（r）。 5.2 敏感基线(EC50)的建立 在番茄主产区未使用某种药剂的田块采集病样，经病组织分离、单孢纯化后共约70株～100株菌株， 采用生长速率法测定该药剂对番茄绵疫病菌的毒力，计算毒力回归曲线方程，求出EC50值。将所有EC50 值按照从小到大排列，平均划分成n个区段（n一般为5～7），以每个区段菌株出现频率（%）为纵轴， 以药剂浓度区段为横轴，建立敏感性频率分布曲线图。利用DPS、SPSS 等统计软件进行敏感性数据正态 性分布检验，如果P值>0.05，即在95%置信限内，敏感性的频率分布呈连续的单峰曲线，且接近正态分 布，没有出现敏感性下降的抗药性群体，则这些菌株可视为野生敏感菌株，根据野生敏感型病原菌群体 对药剂敏感型频率分布为正态分布的原理，可将正态分布峰的平均EC50值作为番茄绵疫病菌对该药剂的 敏感基线(EC50 值)。 5.3 抗性水平 抗性水平＝供试菌株敏感性（ EC50值）×100/敏感基线（ EC50值）。 根据抗药性水平将参试菌株划分为敏感菌株、低抗菌株、中抗菌株和高抗菌株。 5.4 菌株敏感型划分 依据菌株在甲霜灵（或精甲霜灵）与不含药对照上的菌落直径来区分其敏感型，划分标准见表1。 3 DB36/T 1370—2020 表1 菌株对甲霜灵（或精甲霜灵）敏感型的划分标准 敏感型 菌落直径 -1 敏感菌株（S） -1 在含5 μg·mL 、100 μg·mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的黑麦培养基上菌落直径均＜40%对照菌 落直径 -1 抗性菌株（R） 在含5 μg·mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的黑麦培养基上菌落直径＞40%对照菌落直径，在含100 -1 μg·mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的黑麦培养基上菌落直径＜40%对照菌落直径 -1 高抗菌株（HR） -1 在含5 μg·mL 、100 μg·mL 甲霜灵（或精甲霜灵）的黑麦培养基上菌落直径≥40%对照菌落 直径 依据菌株对霜霉威盐酸盐、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、吡唑嘧菌酯、噁霜灵等高度固有抗性风险药剂的 敏感基线和抗性水平来划分其敏感型，划分标准详见表2。 表2 菌株对高度固有抗性风险药剂的敏感型划分标准 敏感型 敏感菌株（S） 敏感基线，抗性水平 敏感性（EC50 值）≤敏感基线的95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基线的95%置信限上限/敏感 基线) 抵抗菌株（LR） (敏感基线的95%置信限上限/敏感基线)<抗性水平≤100 倍 中抗菌株（MR） 100 倍<抗性水平≤500 倍 高抗菌株（HR） 抗性水平>500 倍 依据菌株对霜脲氰、烯酰吗啉、丙森锌、氟吗啉、双炔酰菌胺、氰霜唑、氟啶胺、氟吡菌胺等中低 度固有抗性风险