ICS 07.100.01 CCS B 41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2072—2021 动物垫料中大肠埃希氏菌 O157：H7/NM 检测 Detection of Escherichia coli O157: H7/NM in animal bedding 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2072—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、二连浩特市疾病预防控制中心、内蒙古自治区农 牧业科学院。 本文件主要起草人：赵治国、崔强、郭文丽、延涵、王海艳、陈林军、敖威华、韩祎陟、靳木子、 罗晓平、李军燕。 I DB15/T 2072—2021 动物垫料中大肠埃希氏菌 O157：H7/NM 检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中大肠埃希氏菌O157：H7/NM的定性检测方法、设备和材料、培养基和试剂。 本文件适用于动物垫料中大肠埃希氏菌O157：H7/NM定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注： 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 设备和材料 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 均质器。 振荡器。 电子天平：感量 0.1 g，0.0001 g。 全自动微生物生化鉴定系统。 全自动微生物生化鉴定系统。 酶联免疫分析仪。 二级生物安全柜。 pH 计。 生物显微镜。 1 DB15/T 2072—2021 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 4.21 微量移液器。 无菌锥形瓶：容量 500 mL，250 mL。 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 无菌培养皿：15 mm×90 mm。 无菌棉签。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌勺。 无菌玻片。 无菌接种环。 5 培养基和试剂 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 5.17 实验用水符合 GB/T 6682 的要求。 改良 EC 肉汤（mEC+n） ：见附录 A 中 A.2。 改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC） ：见附录 A 中 A.3。 三糖铁琼脂（TSI） ：见附录 A 中 A.4。 营养琼脂：见附录 A 中 A.5。 半固体琼脂：见附录 A 中 A.6。 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（MUG-LST）：见附录 A 中 A.7。 氧化酶：见附录 A 中 A.8。 革兰氏染液：见附录 A 中 A.9。 大肠埃希氏菌 O157 显色培养基。 大肠埃希氏菌 O157 和 H7 诊断血清。 生化鉴定试剂盒。 革兰氏阴性菌生化鉴定卡。 飞行质谱仪靶板。 大肠埃希氏菌 O157:H7/NM ATCC 35150 或等效标准菌株。 EHEC 肠道出血性大肠埃希氏菌 ATCC 35130 或等效菌株。 大肠埃希氏菌株 ATCC 25922 或等效标准菌株。 6 检验程序 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验流程序见图1。 2 DB15/T 2072—2021 样品制备 2 检样 25 g 或 25 cm 样液+225 mL mEC+n 肉汤 36℃±1℃，18 h～24 h CT-SMAC 平板和大肠埃希氏菌 O157 显色培养基平板 36℃±1℃，18 h～24 h 挑取可疑菌落 5~10 个接种 TSI，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌 MUG-LST 阴性 阴性 非 E.coil O157 血清学实验 生化实验或辅助鉴定 结果报告 图1 大肠埃希氏菌 O157：H7/NM 检验流程 3 DB15/T 2072—2021 7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末 状垫料样品，加入225 mL mEC+n肉汤，充分振摇或均质1 min～2 min，置36℃±1℃培养18 h～24 h， 进行预增菌。 7.1.2.2 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cmÍ5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去 棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重 复取样1～4个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25 mL～100 mL的无菌稀释液中，充分振摇制成样品 原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm2），取样量见表1。取25 mL样品原液加入225 mL mEC+n肉汤， 充分振摇或均质1 min～2 min，置36℃±1℃培养18 h～24 h，进行预增菌。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m 2 取样量 cm 2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 分离培养 分别用接种环取增菌的mEC+n肉汤增菌液1环，划线接种于一个CT-SMAC平板和一个大肠埃希氏菌 O157显色培养基平板，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落，根据菌落形态初 步判定典型和可疑菌落，大肠埃希氏菌O157在各种选择性琼脂平板上的菌落特征见表2。 根据菌落形态挑取5～10个典型菌落或可疑菌落（少于5个时，全部挑取），划线接种于营养琼脂平 板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 表2 大肠埃希氏菌 O157 在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 CT-SMAC平板 大肠埃希氏菌O157显色培养基 4 大肠埃希氏菌O157菌落形态 菌落为圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色。 依据显色培养基的说明书判定。 DB15/T 2072—2021 7.3 鉴定 7.3.1 革兰氏染色镜检 大肠埃希氏菌O157:H7/NM为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，有鞭毛，动力试验结果呈阳性。其鞭毛抗原 丢失，动力试验结果呈阴性。 7.3.2 生化鉴定 挑取纯培养的菌落进行大肠埃希氏菌O157生化鉴定，在CT-SMAC和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板 上分别挑取5～10个可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，并用大肠埃希氏菌株(ATCC 25922或等效标准菌株)做阳性对照和肠道出血性大肠埃希氏菌（ATCC 35130或等效标准菌株）做阴性对 照，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。必要时进行氧化酶试验。 在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。置MUG-LST 肉汤管于长波紫外灯下观察（MUG 阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生，MUG阴性的应无荧光产生）， 大肠埃希氏菌O157：H7/NM 为MUG 试验阴性，无荧光。 大肠埃希氏菌O157生化试验，具体依据大肠埃希氏菌O157生化鉴定试剂盒说明书进行，大肠埃希氏 菌O157生化试验结果见附录B。 7.3.3 辅助鉴定 可根据实验室情况，选用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等进行鉴定，具体操作依据 标准GB/T 33682 和设备操作规范进行。 7.3.4 血清学鉴定 在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，应按照产品说明书用O157和H7诊断血清作玻片凝集试验。对于 H7因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂，检查动力，经连续传代3次。若动力试验结果为阴性， 则确定为无动力菌株。 8 结果报告 综合生化鉴定结果、辅助鉴定结果和血清学试验结果，报告25 g（cm2）动物垫料样品中检出或未 检出大肠埃希氏菌O157：H7/NM。 9 生物安全措施 为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489 的有关规定执行。 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经121 ℃高压灭菌处理至少30 min后再弃置。 5 DB15/T 2072—2021 附 录 A （规范性） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 改良 EC 肉汤(mEC+n) A.2.1 成分 胰蛋白胨20.0 g 3号胆盐 乳糖 K2HPO4•7H2O K2HPO4 NaCL 新生霉素钠盐溶液(20mg/mL) 蒸馏水 1.12g 5.0g 4.0 g 1.5 g 5.0 g 1.0 mL 1000 Ml A.2.2 制法 除新生霉素外，所有成分溶解在水中，加热煮沸，在20℃～25℃下调节pH 至6.9±0.1，分装。于 121℃高压灭菌15min，备用。制备浓度为20mg/mL的新生霉素储备溶液，过滤法除菌。待培养基温度冷 至50℃以下时，按1000mL培养基内加1mL新生霉素储备液，使最终浓度为20mg/L。 A.3 改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂 A.3.1 山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂 A.3.1.1 成分 蛋白胨 山梨醇 3号胆盐 氯化钠 中性红 结晶紫 琼