ICS 07.100.99 CCS B 41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2074—2021 动物垫料中肺炎克雷伯氏菌检测 Detection of Klebsiella pneumonia in animal bedding 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2074—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关。 本文件主要起草人：王海艳、郝广福、赵治国、靳木子、盛万里、马彩霞、敖威华、崔强、陈林军、 延涵、陈宇飞。 I DB15/T 2074—2021 动物垫料中肺炎克雷伯氏菌检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定定性检测法。 本文件适用于动物垫料中肺炎克雷伯氏菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注： 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 均质器。 漩涡振荡器。 电子天平：感量 0.1 g。 全自动微生物生化鉴定系统。 飞行时间质谱仪。 二级生物安全柜。 光学显微镜。 水浴装置：36 ℃±1 ℃。 pH 计。 1 DB15/T 2074—2021 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 4.21 无菌锥形瓶：容量 500 mL，250 mL。 无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 无菌培养皿：15 mm×90 mm。 无菌试管：18 mm×180 mm。 无菌棉签。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌勺。 无菌载玻片。 无菌接种环。 5 培养基和试剂 肺炎克雷伯氏菌常用培养基与试剂灭菌后保存期限见附录B。 5.1 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 5.2 SCDLP 液体培养基：见附录 A 中 A.2。 5.3 胆硫乳琼脂（DHL)：见附录 A 中 A.3。 5.4 营养琼脂培养基：见附录 A 中 A.4。 5.5 革兰氏染色液：见附录 A 中 A.5。 5.6 动力半固体琼脂：见附录 A 中 A.6。 5.7 氧化酶试剂：见附录 A 中 A.7。 5.8 无菌 0.85 %生理盐水：见附录 A 中 A.8。 5.9 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。 5.10 飞行时间质谱仪靶板。 5.11 肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种 ATCC 35657，或等效菌株。 6 检验程序 肺炎克雷伯氏菌检验程序见图1。 2 DB15/T 2074—2021 样品制备 2 检样 25 g 或 25 cm 样液+225 mL SCDLP 增菌 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 划线接种 DHL 琼脂平板 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h，厌氧培养 挑取可疑菌落，接种动力半固体琼脂和营养琼脂 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 革兰氏染色镜检/氧化酶试验 确定鉴定 图1 肺炎克雷伯氏菌检验程序 7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末 状垫料样品，加入225 mL SCDLP，充分振摇或均质1 min～2 min，置36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h进行 增菌。 7.1.2.2 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cmÍ5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（无菌0.85 %生理盐 水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉 3 DB15/T 2074—2021 拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液（无菌0.85 %生理盐水）的无菌锥形瓶中， 根据样品面积大小重复取样1～4个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25 mL～100 mL的无菌稀释液（无 菌0.85 %生理盐水）中，充分振摇制成样品原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm2）。取25 mL样品原 液加入225 mL SCDLP，充分振摇或均质1 min～2 min，置36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h进行增菌。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m 2 取样量 cm 2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 分离培养 将增菌液划线接种DHL琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，观察菌落形态。在DHL平板上肺炎 克雷伯氏菌菌落呈淡粉红色，大而隆起、光滑湿润、粘液状，相邻菌落容易融合成脓汁样，接种针挑取 菌落时呈丝状粘连。 7.3 鉴定 7.3.1 分纯培养 挑取5个（如小于5个则全选）可疑菌落分别接种到营养琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 7.3.2 革兰氏染色镜检 挑取营养琼脂平板上培养的可疑菌落进行革兰氏染色镜检。肺炎克雷伯氏菌为革兰氏染色阴性短杆 菌，单个、成双或成短链排列，有荚膜。 7.3.3 动力试验 挑取营养琼脂平板上培养的可疑菌落穿刺于动力半固体琼脂，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。肺炎 克雷伯氏菌无动力。 7.3.4 氧化酶试验 挑取营养琼脂平板上培养的可疑菌落进行氧化酶试验。肺炎克雷伯氏菌氧化酶试验结果为阴性。 7.3.5 生化鉴定 挑取纯培养的菌落进行肺炎克雷伯氏菌生化鉴定，见表2。具体操作依据肺炎克雷伯氏菌生化鉴定 试剂说明书进行。 4 DB15/T 2074—2021 表2 肺炎克雷伯氏菌生化特性 试验项目 肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种 肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种 肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚种 尿素酶 + d - 靛基质 - - - MR -/+ + + VP + - - 西蒙氏构橡酸盐 + d - D-酒石酸盐 +/- -/+ - 丙二酸盐 + - + ONPG + + - 赖氨酸脱羚酶 + d - 分解葡萄糖产气 + d - 乳糖 + d - 卫矛醇 -/+ - - 注：“+”≥90 %阳性， “+/-”75 %~88 %阳性， “d”为不定， “-/+”75 %~89 %阴性， “-”≥90 %阴性。 7.3.6 辅助鉴定 根据实验室情况，可选用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等进行鉴定，具体操作依据 设备操作规范和标准GB/T 33682进行。 8 结果与报告 综合动力试验结果、氧化酶试验结果、生化鉴定结果和辅助鉴定结果等，报告25 g（cm2）动物垫 料样品中检出或未检出肺炎克雷伯氏菌。 9 生物安全措施 为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489 的有关规定执行。 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经121 ℃高压灭菌处理至少30 min后再弃置。 5 DB15/T 2074—2021 附 录 A （规范性） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 SCDLP 液体培养基 A.2.1 成分 胰蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 磷酸二氢钾 葡萄糖 卵磷脂 吐温-80 蒸馏水 17.0 g 3.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g 1.0 g 7.0 g 1 000 mL A.2.2 制法 将卵磷脂在400 mL蒸馏水中加热溶解，再将其他成分混合加入600 mL蒸馏水中，加热溶解。将上述 两种溶液混合后，搅拌均匀。调节pH至7.2～7.3，分装，121 ℃ 20 min高压灭菌。振荡使沉于底层的 吐温-80充分混合，待冷却至25 ℃左右使用。 A.3 胆硫乳琼脂（DHL) A.3.1 成分 蛋白胨 牛肉膏 乳糖 蔗糖 牛胆盐 硫代硫酸钠 柠檬酸钠 柠檬酸铁馁 中性红 0.03 g或5 g/L水溶液 琼脂 蒸馏水 20.0 g 3.0 g 10.0 g 10.0 g 1.0 g 2.2 g 1.0 g 1.0 g 6 mL 18.0 g～20.0 g 1 000 mL A.3.2 制法 除中性红和琼脂外，将其他成分加入100 mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10 min,加热煮沸至完全 溶解，调节pH至7.3±0.1，再将琼脂加入600 mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10 min,加热煮沸至完全 6 DB15/T 2074—2021 溶解。将两种溶液混合后，再加入5 g/L中性红水溶液6 mL,搅拌均匀，待冷却至50 ℃～55 ℃，倾注平 皿备用。 A.4 营养琼脂 A.4.1 成分 蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼脂 蒸馏水 10.0 g 3.0 g 5.0 g 15.0 g 1 000 mL A.4.2 制法 将各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，调节pH至7.2～7.4，121 ℃灭菌15 min，待冷却至50 ℃～55 ℃， 倾注平皿备用。 A.5 革兰氏染液 A.5.1 结晶紫染液 A.5.1.1 成分 结晶紫 95 ％乙醇 1 ％草酸铵水溶液 1.0