ICS 65.020.30 CCS B 41 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2287—2020 罗氏沼虾双顺反子病毒-1 检测规程 Detection protocols for Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1 2020 - 11 - 30 发布 浙江省市场监督管理局 2020 - 12 - 30 实施 发 布 DB33/T 2287—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规 则起草。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准件由浙江省水产标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省淡水水产研究所。 本标准主要起草人：潘晓艺、沈锦玉、蔺凌云、姚嘉赟、尹文林、曹铮、刘忆瀚、夏炎春。 I DB33/T 2287—2020 引 言 本标准的发布机构提请注意如下事实，声明符合本标准时，可能涉及到6.10-6.11中引物与《罗氏 沼虾双顺反子病毒全基因组序列及其应用》(专利号：201110296487.9)专利权的使用。 本标准的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本标准的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本标准的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得： 专利持有人：浙江省淡水水产研究所 地址：浙江省湖州市吴兴区杭长桥南路999号 请注意除上述专利外，本标准的某些内容仍可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利 的责任。 II DB33/T 2287—2020 罗氏沼虾双顺反子病毒-1 检测规程 1 范围 本标准确立了罗氏沼虾双顺反子病毒-1的检测程序，规定了术语与定义、缩略语、罗氏沼虾双顺反 子病毒-1检测程序的构成、试剂和材料、器材与设备、操作步骤和结果判定。 本标准适用于罗氏沼虾双顺反子病毒-1的检测及关联疾病的流行病学调查、诊断和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7202.1 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第1部分：压片显微镜检查法 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 罗氏沼虾双顺反子病毒-1 Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1 罗氏沼虾幼体死亡综合征的主要病毒性病原，又称为罗氏沼虾太湖病毒（Macrobrachium rosenbergii taihu virus，MrTV），属于小RNA病毒目、双顺反子病毒科、急麻病毒属，病毒粒子为无囊膜的直径约 30 nm的二十面体球形颗粒，核酸类型为单股正链RNA，长度约10.3 kb。其主要侵染罗氏沼虾幼体甲壳 下上皮组织和神经节，造成肝脏和结缔组织出现强嗜碱性细胞质包涵体。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（Base pair） DEPC：焦乙酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine triphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（Deoxyguanosine triphosphate） dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate） 1 DB33/T 2287—2020 dTTP：脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine triphosphate） EB：溴化乙啶，核酸染色剂（Ethidium bromide） MrDV-1: 罗氏沼虾双顺反子病毒-1（Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1） MrTV：罗氏沼虾太湖病毒（Macrobrachium rosenbergii taihu virus） M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus） RdRp：RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase） RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid） RNasin：核糖核酸酶抑制剂（RNase inhibitor） RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction） Taq：水生噬热杆菌（Thermus aquaticus） 5 罗氏沼虾双顺反子病毒-1 检测程序的构成 罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测程序包括5 个阶段，其中RT-PCR操作阶段又分3 个步骤。程序流程图 见图1。 图 1 罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测程序流程图 2 DB33/T 2287—2020 6 试剂和材料 6.1 水：符合 GB/T 6682-2008 中一级水的要求，核酸抽提和 RT-PCR 应使用无 RNA 酶的去离子水。 6.2 dNTPs：含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 10 mmol/L 的混合物，－20 ℃保存。 6.3 RNA 酶抑制剂：40 U/L，－20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.4 M-MLV 逆转录酶：200 U/L，－20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.5 5× M-MLV 逆转录酶缓冲液：－20 ℃保存。 6.6 10× PCR 缓冲液：－20 ℃保存。 6.7 Taq DNA 聚合酶：5 U/L，－20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.8 DNA 分子量标准：DNA Marker DL2000，－20 ℃保存。 6.9 琼脂糖：电泳级。 6.10 RT-PCR 外引物： MrTV572F1：5’-ATGTA-GAGCG-TGGAG-GAGTA-AAA-3’， MrTV572R1：5’-CACTA-TCTCT-GTCTT-CGAGG-GATT-3’， 扩增RdRp基因的572 bp片段。 6.11 RT-PCR 内引物： MrTV472F2：5’-TGCTT-CTATT-TCGGC-TCG-3’， MrTV472R2：5’-CAACG-AATTA-GGGAG-AGG-3’， 扩增RdRp基因的472 bp片段。 6.12 阳性对照为已知受 MrTV 感染且 RT-PCR 结果显示强阳性的虾组织，－80 ℃保存。 6.13 阴性对照为已知未受 MrTV 感染且 RT-PCR 结果显示阴性的虾组织，－80 ℃保存。 6.14 空白对照为无 RNA 酶的水。 7 器材与设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12 普通冰箱。 超低温冰箱：最低可设定温度－86 ℃。 组织研磨器。 生物安全柜或超净工作台。 低温高速离心机：温度可设置范围 0 ℃～40 ℃，最高可设定转速≥15 000 转/分钟。 可控温水浴锅或加热模块。 微量移液器。 PCR 仪。 电泳仪。 水平电泳槽。 紫外透射仪或凝胶成像仪。 微波炉。 8 操作步骤 8.1 样品的准备 样品采集的要求和数量按SC/T 7103和SC/T 7202.1的规定。 3 DB33/T 2287—2020 鲜活幼体、仔虾及体长在3 cm以下稚虾个体样品约30 mg～50 mg (去掉稚虾眼)；成虾取约30 mg～ 50 mg鳃丝或游泳足。 所取样品分别置于1.5 mL无RNA酶微量离心管中，立即进行RNA提取操作或加入1 mL TRIzol试剂， 充分研磨后，暂时保存于－20 ℃。 8.2 RNA 模板的提取 在样品管中加入 1 mL TRIzol试剂，用研磨器研磨，置室温 5 分钟后，加入 0.2 mL 氯仿，震荡 混匀 15 秒，室温放置 5 分钟。于 4 ℃下，12 000 转/分钟 离心 10 分钟，取上层水相，移至一支无 RNA 酶的离心管中。加 0.5 mL 异丙醇，混匀，置室温 10 分钟。于 4 ℃下，12 000 转/分钟离心 10 分 钟，尽弃上清。加入－20 ℃预冷的 1 mL 无 RNA 酶 70%乙醇（无 RNA 酶 70%乙醇的配制按附录 A 中 A.1 进行），振摇 1 分钟，再于 4 ℃下，12 000 转/分钟离心 5 分钟，尽弃上清。敞口离心管，于超净工 作台中室温晾干沉淀。加入 30 L～50 L 无 RNA 酶的水（无 RNA 酶的水的配制按附录 A 中 A.2 进行） 溶解 RNA 沉淀，立即用于 RT-PCR 或保存于－80 ℃备用。同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。RNA 操作时外源性 RNA 酶消除方法按附录 B 进行。个人防护和实验室安全行为等应按 GB 19489 执行。 也可采用等效商业化的 RNA 抽提试剂盒。 8.3 RT-PCR 操作 8.3.1 cDNA 合成 对每一份样品，在一支无RNA酶的0.2 mL PCR管中，加入1.5 L 10 M引物MrTV572R1，2.5 L无 RNA酶水和2 L待测样品RNA模板。混匀后，稍离心，置于70 ℃，10 分钟，然后立即置于冰中。加入2 L 5× M-MLV逆转录酶缓冲液、1 L RNasin (40 U/L)、0.5 L 10 mmol/L dNTPs、0.5 L M-MLV 逆转录酶(200 U/L)，42 ℃保温1 小时，以合成cDNA，然后于80 ℃中5 分钟后，迅速置于冰中。 8.3.2 第一轮 PCR 扩增 对每一份样品，取一支无RNA酶的0.2 mL PCR管，加入2.5 L 10×PCR缓冲液、0.5 L 10 mmol/L dNTPs、0.5 L 10 M引物MrTV572F1、0.5 L 10 M引物MrTV572R1、0.5 L Taq DNA聚合酶(5 U/L)、 18.5 L无RNA酶水和2 L 8.3.1步骤的逆转录产物，最终反应体系为25 L。在PCR后区，置于PCR仪中， 按以下程序进行第一轮PCR扩增： a) 95 ℃ 预变性 3 分钟； b) 94 ℃ 变性 30 秒→62 ℃ 退火