ICS 65.020.01 B05 昆 DB5301 明 市 地 方 标 准 DB5301/T 26—2019 代替 DG5301/T 26-2017 马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定 DNA 分子标记 2019-12-01 发布 昆明市市场监督管理局 2019-12-01 实施 发 布 DB5301/T 26—2019 前  言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由昆明市农业局提出并归口。 本标准起草单位：云南师范大学马铃薯科学研究院、昆明市农业科学研究院。 本标准主要起草人：唐唯、易靖、李灿辉、朱维贤、段晓艳、郝大海、刘卫民、邹万君、李华、 张仲平、李明富、张丽芳、蒋瑜、杨春利。 本标准代替了DG5301/T 26-2017。 I DB5301/T 26—2019 马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定 1 DNA 分子标记 范围 本标准规定了DNA分子标记鉴定马铃薯（Solanum tuberosum L.）品种的方法。 本标准适用于马铃薯品种真实性鉴定和种薯纯度检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于 本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 18133 马铃薯种薯 GB/T 28660 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记 3 术语和定义 GB/T 28660和以下术语及定义适用于本文件。 3.1 简单序列重复 基因组中由1～6个核苷酸残基组成的基本单位串联多次重复构成的DNA序列。 [GB/T 28660，定义3.1] 3.2 聚合酶链式反应 在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。 [GB/T 28660，定义3.2] 3.3 毛细管电泳 是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。 3.4 DNA 分子标记 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 3.5 标准品种 按国家农作物品种审定标准认定的品种。 4 4.1 仪器用具、试剂和软件 仪器及用具 用本方法进行试验时，需要仪器、用具如下： 1 DB5301/ 26—2019 ——PCR 仪（96 孔，梯度）； ——低温高速离心机（4 ℃，16 000 rpm/min）； ——冰箱（-20 ℃，-80 ℃）； ——制冰机(200 kg/天～300 kg/天)； ——高压灭菌器（121 ℃，0.15 MPa）； ——微量移液器（0.5 μL～10 μL、10 μL～100 μL、100 μL～1 000 μL）及配套的枪头； ——凝胶成像仪； ——电泳仪； ——水平电泳槽； ——基因分析仪（Genetic Analyzer, ABI 3500/3730xl 系列）； ——紫外可见分光光度计（190 nm～1 100 nm）； ——0.2 mL PCR 管； ——96 孔测序板； ——石英比色皿。 4.2 试剂 用本方法进行试验时，需要试剂如下： ——常用贮备液（制备方法见附录 A）； ——DNA 提取试剂（制备方法见附录 B）； ——DNA 分子标记引物（见附录 C）； ——Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）和配套的 PCR 缓冲液； ——1 000 bp DNA Marker； ——无 DNA 酶的 RNA 酶 A（DNase-free RNase A）（10 mg/mL）； ——异丙醇； ——乙醇（70%）； ——灭菌双蒸水（ddH2O）； ——甲酰胺（HIDI）； ——分子量内标（GeneScan 500LIZ）； ——EB 染液（100 mL 1×TAE + 5 μL EB 染料）。 4.3 软件 用本方法进行试验时，需要软件如下： ——Data Collection 4.0（ABI）； ——GeneMarker 2.09 (ABI)； ——GeneMapper 4.0 (ABI)； ——Microsoft Excel 2013 (Microsoft corporation)。 5 供试材料 5.1 取样：按照 GB 18133 取样所述方法进行，采集大田植株叶片或块茎作为检测样品。 5.2 样品保存：选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置冰箱（-80 ℃以下）中保存备用（有效保 存期小于等于 6 个月）。 2 DB5301/T 26—2019 6 鉴定程序 6.1 总 DNA 提取 按下列顺序进行 a) b) c) d) e) f) g) h) i) 6.2 称取 100 mg 待测样品，置于预冷 2.0 mL 离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。 依次加入 700 μL 的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（CTAB 缓冲液）（见附录 B 表 B.1）和 2 μL 的β-巯基乙醇涡旋混匀。置 65 ℃水浴 1 h，期间每隔 10 min 摇动混匀一次。 冰上冷却约 10 min 后，加入 700 μL 的氯仿：异戊醇（24:1）混合液（见附录 B 表 B.2），涡 旋混合,轻缓颠倒混匀数次。 12 000 rpm 离心 5 min。吸取上层水相至新 1.5 mL 离心管中，加入等体积（400 μL～500 μL） 的预冷异丙醇。轻缓颠倒混匀。 4 ℃冰箱静置 30 min 后，12 000 rpm 离心 15 min。弃上清液。 向离心管中加入 70%乙醇 1.0 mL，静置 3 min 后，12 000 rpm 离心 20 min。 小心倒出 70%乙醇，再加入 90%乙醇 1.0 mL，静置 5 min 后，12 000 rpm 离心 10 min，小心 倒去乙醇。 在干净的吸水纸上倒置离心管，自然干燥 15 min。 晾干的 DNA，应为透明状。加入 100 μL 的 1×TE 缓冲液，将十倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四 乙酸缓冲液（EDTA 缓冲液）（见附录 B 表 B.3）稀释 10 倍并灭菌]溶解 DNA，再加入 2 μL 的 无 DNA 酶的 RNA 酶 A（10 mg/mL）。37 ℃温浴 1 h 去除 RNA。4 ℃冰箱放置备用。 总 DNA 质量鉴定 6.2.1 取 DNA 提取液 1.0 μL～5.0 μL 于新的 1.5 mL 离心管中，加入 1×TE 缓冲液稀释至 1.0 mL， 混匀后转入石英比色皿中，用紫外分光光度计测定 OD260 和 OD280 下的光密度值（OD260：紫外光 260 nm 下 的光密度值；OD280：紫外光 280 nm 下的光密度值）。用 OD260/OD280 比值判断 DNA 纯度，比值在 1.8～1.9 之间表明 DNA 纯度较高。按公式（1）计算提取液中 DNA 浓度。 dsDNA  OD260  t  50 ................................................................. (1) 1000 式中： dsDNA——双链DNA分子的含量（μg/mL）； OD260——紫外光260 nm下的光密度值； t——稀释倍数。 6.2.2 总 DNA 浓度确定后，用 1×TE 缓冲液将所提取的总 DNA 稀释为终浓度 50 ng/μL，根据每次用 量分装，置-20 ℃冰箱保存备用。 6.3 6.3.1 PCR 反应 PCR 反应体系 在冰盘中或4 ℃条件下，按表1所列成分及其用量，顺序依次加入PCR管，准备 25.0 μL PCR 反应体系。 3 DB5301/ 26—2019 表1 PCR 反应体系 成分 用量 ddH2O 16.1 μL 10× PCR 缓冲液 2.5 μL dNTPs (10 mM) 2.0 μL 正向引物 (10 μM) 1.0 μL 反向引物 (10μM) 1.0 μL Taq DNA 聚合酶 (2.5 U/μL) 0.4 μL DNA 模板 (50 ng/μL) 2.0 μL 总体积 25.0 μL 注：供 1 个样品、1 对引物检测，25μL 6.3.2 反应程序: 按表2程序设置PCR反应流程。 表2 反应程序 时间 94 ℃预变性 5 min 94 ℃变性 1 min 退火 1 min 72 ℃延伸 1 min 循环次数 35 次 72 ℃延伸 5 min 4 ℃终止反应 6.4 PCR 反应程序 备注 不同引物所需的退火温度见附录 C 表 C.1 变性→退火→延伸反应循环次数 PCR 产物放置在 4 ℃冰箱中保存备用 细胞质标记检测用琼脂糖凝胶电泳 6.4.1 器具清洗 首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB 污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医 用纱布擦干。 6.4.2 配胶 制备好的凝胶需平整、不漏孔，方可用于电泳检测。制胶按下列顺序进行： a) b) c) d) e) 4 量取 20 mL 的电泳缓冲液 1×TAE 至锥形瓶中； 再称取 0.4g 的琼脂糖倒入锥形瓶中，摇匀并用保鲜膜封口； 放入微波炉中以 40 %火力加热 60 s，取出摇匀，再次放入微波炉中以 40 % 火力加热至凝胶 完全溶解。制备好的凝胶应为色泽均匀、无气泡； 将制备好的凝胶放入 65 ℃的水浴锅中，待凝胶冷却至 65 ℃时，及时将凝胶倒入装配好的干 净胶槽中； 待凝胶完全凝固后，将胶槽小心转移至 4 ℃冰箱，冷藏 30 min 后拔出梳子； DB5301/T 26—2019 f) 6.4.3 把制备好的凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入电泳 缓冲液（1×TAE）至刚好将凝胶淹没。 上样 取5 μL PCR产物，加入1μL 6×溴酚蓝（见附录A 表A.4）混匀，按胶孔顺序上样并做好记录；以 5 μL的DNA Ladder为分子量标准。 6.4.4 电泳 在电压120 V或400 mA电流条件下，电泳30 min或溴酚蓝条带迁移距至胶板底部1 cm时停止。 6.4.5 染色 电泳结束之后，把凝胶转移到EB染胶盘中，盖上盖子避光染色30 min。 6.4.6 凝胶成像 将凝胶放入凝胶成像系统中，按照凝胶成像系统操作规程进行操作，拍照保存检测结果。 6.5 细胞核标记检测用毛细管电泳分析 6.5.1 内标配置 25 mL Hi-Di和193 μL GeneScan 500liz混合（13