ICS 11.120.10 C 12 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5221—2020 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西 环素、美他霉素的测定 高效液相色谱-串联 质谱法 2020 - 09 - 18 发布 河北省市场监督管理局 2020 - 10 - 18 实施 发 布 DB13/T 5221—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由河北省市场监督管理局提出。 本标准起草单位：河北省环保产品质量监督检验院、张家口翼华环境检测技术有限责任公司、河 北德普环境检测有限公司。 本标准主要起草人：吕晓飞、蔡立鹏、耿晓红、陈静、刘肖肖、何淑娟、张玉、刘娜、孙鹏、王 玲、米卫军、王天星。 I DB13/T 5221—2020 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定高效 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的高效液相色谱-串联质谱测 定方法。 本标准适用于土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定。 按称样量5 g，50 mL提取液中移取10 mL净化，净化液浓缩、定容至1.0 mL，进样量1 μ L分析， 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的检出限为2.5 μ g/kg，测定下限为10 μ g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 HJ/T 166 土壤环境监测技术规范 HJ 613 土壤干物质和水分的测定重量法 3 原理 土壤中四环素类抗生素用Na2EDTA-Mellvaine缓冲液（pH=4.0）+乙腈（7+3）提取，经过滤和离心 后，上清液用HLB固相萃取柱净化。净化液中的四环素类抗生素经高效液相色谱分离，电喷雾离子源离 子化，通过保留时间和特征离子对丰度比定性，峰面积外标法定量。 4 干扰和消除 四环素类抗生素均属于高极性弱酸弱碱化合物，易与土壤中的金属离子、蛋白质结合，影响提取。 通过Na2EDTA-Mellvaine缓冲液可有效防止金属离子与四环素类抗生素螯合。提取液中加入乙腈，并在 低温下离心，可有效去除蛋白质的干扰。提取液经HLB固相萃取柱净化，可进一步去除干扰物质并有效 降低基质对质谱的干扰效应。 5 试剂和材料 5.1 5.2 5.3 5.4 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 甲醇：色谱纯。 乙腈：色谱纯。 乙酸乙酯：色谱纯。 甲酸：色谱纯。 1 DB13/T 5221—2020 5.5 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·H2O）。 5.6 柠檬酸（C6H8O7·H2O）。 5.7 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）。 5.8 柠檬酸溶液（0.1 mol/L）：称取 21.01 g 柠檬酸（5.6），用水溶解，定容至 1 000 mL。 5.9 磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：称取 28.41 g 磷酸氢二钠（5.7），用水溶解，定容至 1 000 mL。 5.10 Mellvaine 缓冲溶液：将 1 000 mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液（5.8）与 625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢 二钠溶液（5.9）混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节 pH=4.0。 5.11 Na2EDTA-Mellvaine 缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取 60.5 g 乙二胺四乙酸二钠（5.5）放入 1 625 mL Mellvaine 缓冲溶液（5.10）中，使其溶解，摇匀。 5.12 Na2EDTA-Mellvaine 缓冲溶液+乙腈（7+3）：量取 700 mL Na2EDTA-Mellvaine 缓冲溶液与 300 mL 乙腈混合。 5.13 甲醇+水（1+19）：量取 5 mL 甲醇（5.1）与 95 mL 水混合。 5.14 甲醇+乙酸乙酯（1+9）：量取 10 mL 甲醇（5.1）与 90 mL 乙酸乙酯（5.3）混合。 5.15 HLB 固相萃取柱：二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮复合填料萃取柱（60 mg，3 mL），或其他性能 相 5.16 近的固相萃取小柱。使用前用 5 mL 甲醇、5 mL 水活化处理，保持柱体湿润。 5.17 甲酸水溶液（0.1%）：准确量取 1.0 mL 甲酸（5.4）于 1 000 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至 刻度。 5.18 乙腈+甲酸水溶液（2+8）：量取 20 mL 乙腈（5.2）与 80 mL 甲酸水溶液（5.16）混合。 5.19 标准物质：土霉素（oxytetracycline，CAS：6153-64-6）、金霉素（chlortetracycline，CAS： 57-62-5）、四环素（tetracycline，CAS：60-54-8）、多西环素（doxycycline，CAS：564-25-0）、 美他霉素（methacycline，CAS：914-00-1）。纯度均大于或等于 95%。 5.20 标准储备液（100 μ g/mL）：准确称取土霉素、金霉素、四环素、多西环素和美他霉素各 10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至 100 mL，4℃贮存于密封棕色瓶中。 5.21 混合标准中间液（1 000ng/mL）：准确吸取各标准储备液（5.19）1mL 于 100mL 容量瓶中，用 甲醇定容至刻度，摇匀，4℃贮存于密封棕色瓶中。 5.22 混合标准使用液：准确吸取混合标准中间液（5.20）0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL，于 5 个 10mL 容量瓶中，用乙腈+甲酸水溶液（5.17）定容，此标准系列中各抗生素的浓度分别为：10、50、100、 200、500 ng/mL。 6 仪器与设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 2 高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。 电子天平：感量 0.01g 和 0.0001g。 快速混匀器。 离心机：转速不低于 5000r/min。 氮吹浓缩仪。 固相萃取真空装置。 pH 计：测量精度±0.02。 超声提取器。 往复式振荡器（频率不低于 100 次/min）。 一般实验室常用仪器和设备。 DB13/T 5221—2020 7 样品 7.1 样品采集和保存 土壤样品按照HJ/T 166的相关要求进行采集和保存。样品应于洁净的具塞磨口棕色玻璃瓶中保存。 运输过程中应密封、避光、4 ℃以下冷藏。运至实验室后，若不能及时分析，应于4 ℃以下冷藏、避 光、密封保存，保存时间不超过10天。 7.2 样品的制备 将样品混匀，除去样品中的异物（枝棒、叶片、石子等），按照HJ/T 166的要求，将采集的样品 在实验室中自然风干、破碎、过60目筛，保存备用。如果土壤中水分含量较高（大于30%），应先进行 离心分离出水相，再进行干燥处理。 7.3 干物质的测定 土壤样品干物质含量按照HJ 613测定。 7.4 试样的制备 7.4.1 提取 称取5 g（精确至0.0001g）土壤样品于50 mL离心管中，加入20 mL Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液+ 乙腈（7+3）（5.12），涡旋混匀1min使其分散，然后超声提取30 min、往复振荡（100次/min）提取 30 min。取出离心管，5000 r/min条件下离心5 min，转移上清液至50 mL容量瓶中。再分别用20 mL、 10 mL Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液+乙腈（7+3）（5.12）重复提取两次，合并上清液，定容至50 mL， 用快速滤纸过滤，待净化。 7.4.2 净化 准确移取10.0 mL滤液，以0.5 mL/min速度通过HLB固相萃取柱（5.15），然后依次用5 mL水和5 mL 甲醇+水（5.13）淋洗，弃去淋洗液。2.0 kPa以下减压抽干5 min，用10 mL甲醇+乙酸乙酯（5.14）洗 脱。将洗脱液氮吹浓缩至干，用1.0 mL乙腈+甲酸水溶液（5.17）溶解残渣，过0.22 μm滤膜，待测定。 7.5 空白试样的制备 不称取样品，按照与试样制备（7.4）相同的步骤进行空白试样的制备。 8 分析步骤 8.1 色谱参考条件 a) b) c) d) e) 色谱柱：联苯色谱柱（3.0 mm×50 mm，2.6μ m），或相当者； 流动相：乙腈（5.2）+甲酸水溶液（5.16），梯度洗脱（梯度洗脱程序见表 1）； 流速：0.5 mL/min； 柱温：35 ℃； 进样量：1μ L。 3 DB13/T 5221—2020 表1 梯度洗脱程序 时间/min 乙腈/% 甲酸水溶液/% 0 20 80 3.5 30 70 3.6 60 40 4.5 60 40 4.6 20 80 5.5 20 80 8.2 质谱参考条件 离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；其他参考质 谱条件见附录A。 8.3 定性测定 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在±0.5%之内。每种化合物的质 谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，且同一检测批次，对同一化合物，样品 中目标物的两个离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。 表2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%～50% ＞10%～20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 8.4 定量分析 在8.1和8.2仪器条件下，对系列标准溶液（5.21）和试样溶液（7.4.2）进行分析。以标准样品中 四环素类抗生素的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归方程，计算出试样溶液中四环素类抗 生素的浓度。标准溶液的色谱图参见附录B。 8.5 空白试验 按照与试样测定（8.1）相同的仪器条件进行空白试样（7.5）的测定。 9 结果计算与表示 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素和美他霉素的含量X 按式（1）计算： ……………………………(1) 式中： X——土壤中各被测组分的含量，单位为微克每千克（μ g/kg）； Ci——试样溶液中各被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； C0——空白试样溶液中各被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； 4 DB13/T 5221—2020 V——试样最终定容体积，单位为毫升（mL）； m