ICS 65.020.20 B 21 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 3860—2020 玉米品种及纯度鉴定技术规程 SNP 标记法 Technical regulation for identification of maize varieties and purity — SNP marker method 2020 - 10 - 13 发布 江苏省市场监督管理局 2020 - 11 - 13 实施 发 布 DB32/T 3860—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：赵涵、张体付、吕远大、陈艳萍、林峰、陆海燕、梁帅强。 I DB32/T 3860—2020 玉米品种及纯度鉴定技术规程 SNP 标记法 1 范围 本标准规定了利用 SNP（single nucleotide polymorphism）标记进行玉米品种及纯度鉴定的原理、仪 器设备及试剂、引物信息、操作步骤等要求。 本标准适用于玉米自交系、单交种及纯度的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SNP 标记 single nucleotide polymorphism marker 基于单核苷酸多态性的分子标记。 3.2 推荐引物 recommended primer 品种鉴定中优先选用的一套 SNP 引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。 3.3 竞争性等位基因特异性 PCR（KASP, Kompetitive Allele Specific PCR） 通过引物末端特异性碱基竞争性匹配 DNA 模板实现 SNP 基因分型的链式聚合酶反应。 3.4 品种纯度 varietal purity 品种在 DNA 分子标记基因分型方面一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占供检样品种子总 数的百分率表示。 1 DB32/T 3860—2020 4 原理 玉米基因组中普遍存在着单碱基的变异，不同品种同一 SNP 位点的基因型可利用适宜引物通过 KASP 检出，进而根据 SNP 位点基因型的差异鉴定品种及纯度。 5 仪器设备及试剂 见附录A。 6 引物信息 见附录B。 7 操作步骤 7.1 样品 DNA 提取 7.1.1 样品准备 试验样品种子的分样与保存，应符合GB/T 3543.2的规定。 7.1.2 用于品种鉴定样品 DNA 提取 从送检样品中随机抽取 10 粒种子发苗。分单株剪取 100 mg 幼苗用液氮研磨，将研磨粉末转入 2 mL 离心管，加入 0.5 mL 2×CTAB 提取缓冲液充分混匀。在55℃ ～65℃ 恒浴 30 min。加入 1 mL 氯仿:异戊 醇（24：1），充分摇动 5 min，8 000 g，室温下离心 5 min。取上清液加入0.6×体积异丙醇，室温下静 置 30 min，5 000 g，4 ℃ 离心 5 min。沉淀用 0.8 mL 高盐缓冲液充分溶解，15 000 g 离心 2 min。上清 加入 0.6×体积异丙醇，室温下静置 30 min，5 000 g，4 ℃ 离心 5 min。沉淀用 400 µL 双蒸水溶解，加 入 2.5×体积 95% 的预冷乙醇，﹣20 ℃ 冰箱放置 2 h 以上，15 000 g 离心 20 min。用 70% 的预冷乙醇洗 一次，自然干燥后，用 200 μL 0.1×TE 缓冲液溶解，置 4 ℃ 保存。 注：以上为推荐用于品种鉴定的 DNA 提取方法，其他能够达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法都适用于本标 准。 7.1.3 用于纯度鉴定样品 DNA 提取 按GB/T 3543.4规定的方法，从送检样品中抽取不少于 100 粒种子发苗。分单株剪取0.5 cm～1 cm 长的幼苗，放入 96 孔 PCR 板的孔中，每孔 1 株幼苗样品。每孔加入 40 μL DNA 提取试剂盒Ⅰ缓冲液， 在沸水中煮沸 30 s，然后加入 60 μL DNA 提取试剂盒Ⅱ缓冲液，在沸水中煮沸 2 min，置 4 ℃ 保存，保 存不超过 7 d。 注：以上为推荐用于纯度鉴定的 DNA 提取方法，其他能够达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法都适用于本标 准。 7.2 PCR 扩增 7.2.1 引物筛选 用于品种及纯度鉴定的 40 组推荐引物及其序列参见附录B。 2 DB32/T 3860—2020 自行筛选引物时，取送检杂交种及父、母本种子各 5 粒，通过 KASP 对一系列 SNP 分子标记引物 进行筛选，确定适宜的引物。适宜引物应为能够清晰区分杂交种及其父、母本的共显性引物。 7.2.2 PCR 反应体系 在 5 μL 的反应体系中进行扩增。反应体系包含 0.07 μL 引物 KASP Assay mix，2.5 μL 2×KASP Master mix，50 ng 模板 DNA。扩增反应条件为：PCR 程序为 94 ℃ 预变性 15 min；94 ℃ 变性 20 s，61 ℃ 退火和延伸 60 s，10个循环, 每个循环降低 0.6 ℃； 94 ℃ 变性 20 s， 55 ℃ 退火和延伸 60 s，26 个循 环。反应利用 96 孔 PCR 板在 PCR 扩增仪上进行。 7.3 基因分型检测 在微孔板荧光分析仪上读取荧光信号, 使用荧光结果处理软件按照分型明确、NTC (无样品阴性对 照)无特异性扩增的原则进行样品 SNP 分型。 7.4 数据采集与判定 7.4.1 数据记录 纯合位点的基因型数据记录为 X/X 和 Y/Y，其中 X、Y 为同一位点上两个不同的等位变异；杂合 位点的基因型数据记录为 X/Y；缺失位点等位变异数据记录为 -/-。 7.4.2 品种鉴定的判定 根据送检样品在 40 个 SNP 位点基因型的差异进行品种鉴定，具体判定标准如下： ——差异位点数≥ 4，判定为不同品种； ——差异位点数≥ 1 且≤ 3，判定为近似品种； ——差异位点数= 0，判定为极近似或相同品种。 对利用附录 B 中 40 组引物仍未检测到≥ 4 个差异位点数的样品，必要时可增加自行筛选引物进行 检测。 7.4.3 纯度鉴定的判定 品种纯度按照下列公式计算： 品种纯度%（自交系）=（供检种子粒数-非本品种种子粒数）/供检种子粒数×100% 品种纯度%（单交种）=（供检种子粒数-母本种子粒数-其他类型种子粒数）/供检种子粒数×100% 3 DB32/T 3860—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 仪器设备及试剂配制 A.1 仪器设备 仪器设备包括： ——微孔板荧光分析仪； ——PCR 扩增仪； ——电子天平（感量 0.01 g，0.001 g）； ——冰箱； ——微量加样器（0.1 µL ～ 2.5 µL, 0.5 µL ～ 10 µL, 20 µL ～ 200 µL, 100 µL ～ 1 000 µL）； ——磁力搅拌器； ——高压灭菌锅； ——酸度计等； ——离心管（0.5 mL，1.5 mL）； ——吸头(10 µL，200 µL，1 000 µL)； ——96 孔 PCR 板；封板膜； ——一次性手套； ——离心管架； ——水平仪。 A.2 试剂配制 A.2.1 DNA 提取试剂Ⅰ 称取 1 g 氢氧化钠溶于 99 mL 水中。 A.2.2 DNA 提取试剂Ⅱ 取 10 mL 12 mol/L 的盐酸溶于 470 mL 水中即成 0.25 mol/L 盐酸。将 0.25 mol/L 盐酸与 0.5 mol/L Tris (PH8.0)按 2：1 稀释。 A.2.3 1 mol/L Tris 溶液(PH8.0) 称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），加入 800 mL 双蒸水中溶解，加入浓盐酸 58.4 mL，加水 定容至 1 000 mL。 A.2.4 0.5 mol/L EDTA 溶液（PH8.0） 称取 186.6 g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA•2H2O），加入 700 mL 双蒸水中溶解，加入 20 g 氢氧 化钠，加水定容至 1 000 mL。 A.2.5 2×CTAB 提取缓冲液 4 DB32/T 3860—2020 2% CTAB（w/v），100 mmol/L Tris(pH8.0)，20 mmol/L EDTA (pH8.0)，1.4 mol/L 氯化钠，1% PVP Mr40 000。称取 20 g 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，81.9 g 氯化钠，10 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）， 加入100 mL 1 mol/L Tris溶液 (PH8.0)和 40 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（PH8.0），加水定容至 1 000 mL。 A.2.6 高盐缓冲液 10 mmol/L Tris (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)，1 mol/L 氯化钠。称取 58.5 g 氯化钠,加入 10 mL 1 mol/L Tris 溶液 (PH8.0)和 2 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（PH8.0），加水定容至 1 000 mL。 A.2.7 0.1xTE 缓冲液 1 mmol/L Tris(pH8.0)，0.1 mmol/L EDTA (pH8.0)，1 mL 1 mol/L Tris 溶液(PH8.0)和 0.2 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（PH8.0），加水定容至 1 000 mL。 A.2.8 2×KASP Master mix 试剂 包含 TaqDNA 聚合酶、带有荧光的接头序列、镁离子、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP），ROX 内参 荧光染料。 A.2.9 KASP Assay mix 包含 46 μL ddH2O、12 μL 100 μmol/L 特异性引物F1、12 μL 100 μmol/L 特异性引物F2、30 μL 100 μmol/L 通用引物。 5 DB32/T 3860—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 推荐使用的 40 组 SNP 引物序列及其玉米基因组分布 推荐使用的 40 组 SNP 引物序列及其玉米基因组分布见表B.1。 表B.1 40 组 SNP 引物序列及其玉米基因组分布 引物名称 色 体 JAASKASP1 1 JAA