ICS 07.100.99 CCS B 41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2075—2021 动物垫料中金黄色葡萄球菌检测 Detection of staphylococcus aureus in animal bedding 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2075—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关。 本文件主要起草人：赵治国、陈林军、韩祎陟、崔强、敖威华、延涵、王海艳、杨帆、靳木子、盛 万里、马彩霞。 I DB15/T 2075—2021 动物垫料中金黄色葡萄球菌检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中金黄色葡萄球菌的定性检测方法。 本文件适用于动物垫料中金黄色葡萄球菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注： 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 冰箱：2 ℃～5℃。 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 均质器。 振荡器。 电子天平：感量 0.1 g。 全自动微生物生化鉴定系统。 飞行时间质谱仪。 二级生物安全柜。 光学显微镜。 pH 计。 高压蒸汽灭菌器。 1 DB15/T 2075—2021 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 4.21 无菌锥形瓶：容量 500 mL，250 mL。 无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 无菌培养皿：15 mm×90 mm。 无菌试管：18 mm×180 mm、13 mm×130 mm。 无菌棉签。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌勺。 无菌玻片。 无菌接种环。 5 培养基和试剂 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 生理盐水：见 A.2。 磷酸盐缓冲液(PBS)：见 A.3。 7.5%氯化钠肉汤：见 A.4。 Baird-Parker 平板：见 A.5。 血琼脂平板：见 A.6。 金黄色葡萄球菌显色培养基。 脑心浸出液肉汤(BHI)：见 A.7。 兔血浆：见 A.8。 营养琼脂小斜面：见 A.9。 革兰氏染液。 革兰氏阳性菌生化鉴定卡。 飞行质谱仪靶板。 金黄色葡萄球菌标准菌株 ATCC 13311，或等效菌株。 大肠杆菌标准菌株 CMCC 44102，或等效菌株。 6 检验程序 金黄色葡萄球菌检验程序见图1。 2 DB15/T 2075—2021 样品制备 2 检样 25 g 或 25 cm 检液+7.5 %氯化钠肉汤 血琼脂平板（或金黄色葡萄球菌显色培养基） Baird Parker 平板 挑取纯培养的可疑菌落 全自动微生物鉴定系统 BHI 肉汤和营养琼脂小斜面 染色镜检 观察溶血 金黄色葡萄球菌 血浆凝固酶试验 非金黄色葡萄球菌 报告 图1 金黄色葡萄球菌检验程序 3 DB15/T 2075—2021 7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少 250 g，充分混匀后称取 25 g 颗粒状或粉 末状垫料样品，加入 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤，充分振摇或均质 1 min～2 min，置 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 进行预增菌。 7.1.2.2 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cmÍ5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生 理盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪 去棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL 无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大 小重复取样 1～4 个规格板面积，相应地将棉拭子头置入 25 mL～100 mL 的无菌稀释液中，充分振摇制 成样品原液（1 mL 原液对应的样品面积为 1 cm2） 。取 25 mL 样品原液加入 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤， 充分振摇或均质 1 min～2 min，置 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 进行预增菌。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m 2 取样量 cm 2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 分离培养 将增菌后的培养物，分别划线接种于 Baird-Parker 平板和血琼脂平板（或金黄色葡萄球菌显色平 板） ，于 36℃±1℃培养，其中 Baird-Parker 平板培养 24 h～48 h，血琼脂平板和金黄色葡萄球菌显色 平板培养 18 h～24 h；分别观察各个平板上生长的菌落，根据菌落形态初步判定典型菌落和可疑菌落， 金黄色葡萄球菌在各种选择性琼脂平板上的菌落特征见表 2。 根据菌落形态挑取至少 5 个典型或可疑菌落（少于 5 个时，全部挑取），划线接种于营养琼脂平板， 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 根据菌落形态挑取至少 5 个典型或可疑菌落（少于 5 个时，全部挑取），划线接种于营养琼脂平板， 4 DB15/T 2075—2021 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 表2 金黄色葡萄球菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 Baird-Parker平板 血琼脂平板 金黄色葡萄球菌显色培养基 金黄色葡萄球菌菌落形态 菌落为圆形，光滑、凸起、湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带， 在其外层有一透明带。 菌落呈金黄色，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。 按照显色培养基的说明进行判定。 7.3 鉴定 7.3.1 革兰氏染色镜检 挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色、镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状， 无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为 0.5 μm～1 μm。 7.3.2 血浆凝固酶试验 挑取 Baird-Parker 平板或血平板上至少 5 个可疑菌落(小于 5 个全选)，分别接种到 5 mL BHI 和营 养琼脂小斜面，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 取新鲜配制兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI 培养物 0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，置 36℃ ±1℃温箱或水浴箱内，在 6 h 内观察结果，每 30 min 观察一次，如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时， 呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球 菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 如结果可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 ℃±1 ℃培养 18 h～48 h，重复试验。 7.3.3 辅助鉴定 可根据实验室情况，选用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等进行鉴定，具体操作依据 标准 GB/T 33682 和设备操作规范进行。 8 结果报告 综合革兰氏染色镜检结果、血浆凝固酶试验结果和辅助鉴定结果等，报告 25 g（cm2）动物垫料样 品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。 9 生物安全措施 为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照 GB 19489 的有关规定执行。 5 DB15/T 2075—2021 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经 121℃高压灭菌处理至少 30 min 后再弃置。 6 DB15/T 2075—2021 附 录 A （规范性） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 生理盐水 A.2.1 成分 氯化钠 蒸馏水加至 8.5 g 1 000 mL A.2.2 制法 溶解后，高压灭菌121 ℃，20 min。 A.3 磷酸盐缓冲液(PBS) A.3.1 成分 磷酸二氢钾(KH2PO4) 蒸馏水 34.0 g 500 mL A.3.2 制法 贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。 A.4 7.5 %氯化钠肉汤 A.4.1 成分 蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 蒸馏水加至 10.0 g 3.0 g 75.0 g 1 000 mL A.4.2 制法 将上述成分加热溶解，调节pH至7.4±0.2，分装，121 ℃高压灭菌15 min。 A.5 Baird-Parker 平板 A.5.1 成分 胰蛋白胨 牛肉膏 酵母浸膏 10.0 g 5.0 g 1.0 g 7 DB15/T 2075—2021 丙酮酸钠 10.0 g 甘氨酸 12.0 g 氯化锂（LiCl•6H2O） 5.0 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 950 mL pH 7.0±0.2 增菌剂的配制：30 %