ICS 65.150 B 52 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3925—2020 白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增 (LAMP)检测技术规范 Technical specification of detecting white-spot syndrome virus (WSSV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 2020 -12- 15 发布 江苏省市场监督管理局 2021 -01- 15 实施 发 布 i DB32/T 3925—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作到则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的附录A、B为资料性附录。 本文件由苏州大学提出并归口。 本文件起草单位：苏州大学、江苏省水生动物疫病预防控制中心 本文件主要起草人：薛仁宇、贡成良、陈辉、曹广力、魏育红、方苹、胡小龙、朱敏、刘波。 I DB32/T 3925—2020 白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术规范 1 范围 本文件规定了用LAMP技术检测白斑综合征病毒的方法。 本文件适用于环介导等温扩增(LAMP)对虾、蟹白斑综合征病毒的鉴定及其检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅改日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103—2008 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 环介导等温扩增 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 一种新的等温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异性引物，利用一种链置 换 DNA 聚合酶在等温条件下保温 30 min-60min，所完成的核酸扩增反应。 4 试剂和材料 4.1 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 4.2 模板制备缓冲液 缓冲液中含 20 mM Tris-HCl，10 mM KCl，体积百分数 0.1% Triton X-100，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，-20 ℃保存。 4.3 Bst DNA 聚合酶 8U/μL，-20 ℃保存，不能在反复冻融或经历温度剧烈变化情况后使用。 4.4 dNTPs 混合物 含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 2.5 μmol/L 的混合物，-20℃保存，不宜在反复冻融或温度剧烈 1 DB32/T 3925—2020 变化后使用。 4.5 染色剂 10000× SYBR Green I，-20℃避光保存。 4.6 引物 检测所用 4 条引物，其序列如下: F3：5′-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3′ B3：5′-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3′ FIP：5′-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT-3′ BIP：5′-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGT TTA CGA CAA-3′ 4.7 阳性对照 阳性对照为包括已知 WSSV ORF 234 片段的 pET-28a(+)-234 质粒，且 PCR 及 LAMP 检测结果为 阳性的质粒 DNA 模板。将提纯的 pET-28a(+)-234 质粒根据 OD260 吸光度值计算浓度，用 TE 缓冲液稀 释至 150 pg/μL，-20℃保存。 4.8 阴性对照 阴性对照为不含 WSSV 基因的 pET-28a(+)空载质粒， 且 LAMP 检测结果为 WSSV 阴性的质粒 DNA 模板。将提取 pET-28a(+)空载质粒根据 OD260 吸光度值计算浓度，用 TE 稀释至 150 pg/μL，-20℃保存。 5 主要仪器和设备 5.1 高速冷冻离心机：最高转速可达 15000 r/min 以上，配备能使用 1.5 mL 离心管的转头。 5.2 微量移液器。 5.3 高精度恒温仪：控温精度±0.2℃。 5.4 凝胶成像仪或紫外灯。 5.5 水浴锅。 6 操作步骤 6.1 取样 待检的虾、蟹，如虾体长不超过 2 cm，取将整个虾去壳，虾体长超过 2 cm，取虾头部，去壳；蟹 体重不超过 5 g，取整个蟹，去壳，蟹体重超过 5 g，去壳，取组织肝胰腺、心、鳃组织。样品采集按 SC/T 7103—2008 中 6.1 的规定执行。 2 DB32/T 3925—2020 6.2 制样 将待检新鲜组织 0.2 g，剪碎后研磨或进行组织匀浆至无明显组织块后置于 1.5 ml 离心管内。加入 100 μL 模板制备缓冲液，沸水浴 5 min，12000 r/min 离心 1min，上清转移至新的 1.5 ml 离心管内，样 品应现制现测。 6.3 LAMP 扩增 按下表加入除了 Bst DNA 聚合酶以外的各项试剂，配成无酶反应预混液。 表 1 25 μL LAMP 扩增反应体系 6.4 试剂 体积(μL) 10×反应缓冲液 2.5 10 μM dNTPs 1 10 μM FIP 2 10 μM BIP 2 10 μM F3 0.5 10 μM B3 0.5 灭菌双蒸水 14.5 配制完全反应预混液 将无酶反应预混物单支分装到 0.2 mL PCR 管中，保存于-20℃。在临用前，室温融解，按 23 μL 无酶反应预混液加 1 μL Bst DNA 聚合酶混匀，配制完全反应预混液。 6.5 加样 按 每 管 24 μL 完 全 反 应 预 混 液 ， 分 别 在 对 应 管 中 加 入 待 检 样 品 模 板 1 μL 、 阳 性 对 照 pET-28a(+)-234 质粒 1 μL、阴性对照 pET-28a(+)空载质粒 1 μL，混匀。 6.6 孵育 将上述 PCR 管置于高精度恒温仪中，于 63.0 ℃ ±0.2℃ 反应 55 min。 6.7 染色 LAMP 扩增反应结束后，取反应液 1 μL，加入到含有 38 μL 无菌双蒸水、1 μL 100 倍稀释的 10000× SYBR Green I 的 200 μL PCR 管中，混匀后室温放置 3 min ，置于紫外灯或凝胶成像仪下观 察，记录结果。 3 DB32/T 3925—2020 7 结果判断 7.1 LAMP 扩增产物在紫外灯或凝胶成像仪下，阳性对照出现绿色荧光，阴性对照无绿色荧光，如待 测样品出现绿色荧光则判定为阳性。 7.2 如阴性对照出现绿色荧光则判定为试剂或器械污染。 7.3 如阳性对照没有出现绿色荧光则判定为试剂失效或仪器工作不正常。 白斑综合征病毒（WSSV）LAMP 检测结果示意图参见附录 B。 4 DB32/T 3925—2020 附 录 A (规范性) 试剂及其配制 A.1 模板制备缓冲液 分别配制 50 mM Tris-HCl，100 mM KCl，50 mM (NH4)2SO4，20 mM MgSO4 的母液。 在 46.9 mL 无菌双蒸水中分别加入 40 mL Tris-HCl (50 mM)、1 mL KCl (100 mM)、2 mL NH4)2SO4 (100 mM)、10 mL MgSO4 (2 mM)、0.1 mL Triton X-100 混匀，4℃保存。 A.2 SYBR Green I 将 10000×SYBR Green I 商品原液 10 μL 与 990 μL 无菌双蒸水混合，装在聚丙烯类管中 4℃～8℃ 密闭避光保存。2 个月内使用有效。 A.3 TE 缓冲液（pH 8.0） 取 5 mL 初始浓度为 1 mol/L 的 Tris·Cl (pH 8.0)和 0.5 mol/L 的 EDTA (pH 8.0) 1 mL，向烧杯中加入 400 mL 双蒸水混合均匀，将溶液定容到 500 mL 后高温高压灭菌，4℃～8℃保存。 i DB32/T 3925—2020 附 录 B (资料性) 白斑综合征病毒（WSSV）LAMP 检测结果示意图 图 B.1 白斑综合征病毒（WSSV）LAMP 检测结果示意图 ii