ICS65.020.30 CCSB43DB50 重庆市地方标准 DB50/T1460—2023 地方猪耳缘成纤维细胞制备 与冻存技术规范 2023-09-15发布 2023-12-15实施 重庆市市场监督管理局  发布 DB50/T1460—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由重庆市农业农村委员会提出、归口并组织实施。 本文件起草单位：重庆市畜牧科学院、重庆市畜牧技术推广总站、四川省内江市农业科学院。 本文件主要起草人：龙熙、潘红梅、朱燕、郭宗义、张亮、周旗、任素碧、涂志、柴捷、易霞。 DB50/T1460—2023 1地方猪耳缘成纤维细胞制备与冻存技术规范 1范围 本文件规定了地方猪耳缘成纤维细胞制备和冻存的试验材料、仪器设备、采样要求、样品采集、样 品处理、分离培养和冻存的要求。 本文件适用于地方猪耳缘成纤维细胞制备和冻存。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T3075畜禽养殖场消毒技术 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 耳缘成纤维细胞earmarginfibroblasts 取自猪耳缘部位的组织，通过分离培养，获得的成纤维细胞。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DMEM：杜氏培养基（Dulbecco'smodifiedeaglemedium） DPBS：杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco'sPhosphate-BufferedSaline） DMSO：二甲基亚砜（DimethylSulfoxide） 5试验材料、仪器设备 5.1主要仪器设备及耗材 5.1.1仪器设备。低温保存箱、二氧化碳培养箱、低速离心机、超净工作台、恒温水浴锅、显微镜、移 液枪等。 5.1.2消毒用品。75%酒精、碘伏。 5.1.3防护用品。防护服、口罩、无菌帽、橡胶手套等。 5.1.4实验用具。耳缺钳、剪刀、镊子、刀片、细胞培养皿（瓶）、离心管、酒精灯、巴斯德吸管等。 DB50/T1460—2023 25.2实验用水及相关溶液 5.2.1实验用水。应符合GB/T6682中4.2二级水要求。 5.2.2样品培养及保存液。样品培养及保存液配制方法见附录A。 6采样要求 6.1采样猪只应为健康活体。濒危猪种可在死亡后24h内采样。 6.2采样用具应无菌。 6.3采样人员安全防护应符合NY/T541的要求。 6.4采样场所消毒应按照NY/T3075执行。 7样品采集 7.1选择耳缘避开大血管的较薄部位消毒，用耳缺钳取长宽5mm～6mm的样品。 7.2清理样品上较长毛发后，转移至加有75%酒精的离心管中，摇晃震荡30s。取出样品，用DPBS 将样品上的酒精冲洗干净，再移至加有DMEM的离心管中，封口、标记，放入低温保存箱。 7.3在采样登记表（见附录B）上登记。 7.4采样结束，样品即送实验室。 7.5废弃物应无害化处理。 8样品处理 8.1在超净工作台中，将样品转移至加有75%酒精的离心管中震荡摇晃30s，用DPBS清洗，去 除毛发和表皮，再用DPBS将样品清洗干净。 8.2将经8.1处理的样品置于75%酒精中浸泡消毒30s，再用DPBS清洗干净。 9分离培养 9.1原代细胞 9.1.1将样品剪成小于1mm3的碎块，用巴斯德吸管转移至细胞培养皿（瓶）中，使其均匀分布于皿 （瓶）底。 9.1.2将培养皿（瓶）倒置，放于37℃二氧化碳培养箱中培养4h～6h，每2h观察1次。 9.1.3样品块贴壁后，往培养皿（瓶）中加入4mL预热至37℃的DMEM，12h后观察是否污染， 若有污染丢弃或二次清洗。 9.1.4每隔1d观察细胞迁出及其生长状况。 9.1.5标记细胞处理方式和细胞状态，记录细胞分离培养日志（见附录C）。 9.2传代细胞 9.2.1在显微镜下观察原代细胞的汇合度，达到70%～90%时，进行传代培养。 9.2.2超净台中剔除9.2.1培养皿（瓶）中的样品块，用DPBS清洗细胞2～3次，弃废液。向培养 皿（瓶）中加入1mL胰酶，放入培养箱中消化3min，取出培养皿（瓶），用显微镜观察细胞的脱壁 DB50/T1460—2023 3情况，待细胞变圆并大部分脱壁后，立即加入2mLDMEM终止消化。将细胞悬液转移至离心管中，1 000rpm离心5min，留细胞沉淀。 9.2.3加入DMEM重悬细胞，取细胞悬液均匀接种于2个细胞培养皿（瓶）中，标记为P1代细 胞，放入二氧化碳培养箱中继续培养，每2d换1次DMEM。 9.2.4细胞汇合度为70%～90%时，进行下一次传代。 9.2.5标记细胞处理方式和细胞状态，记录细胞分离培养日志（见附录C）。 10冻存 10.1弃去培养皿（瓶）中的培养液，用预热至37℃的DPBS洗涤细胞1～2次。重复本文件9.2.2 操作1次。 10.2弃去细胞培养液，加入20℃～25℃的冷冻液，使细胞重悬浮，调整细胞密度为1~5×106个/mL。 冻存管分装，标记细胞来源、代次与冻存日期。 10.3将分装好的细胞冻存管放入程序降温盒，-80℃冰箱中冷冻8h～16h，转移至液氮罐中长期储 存。 10.4做好冻存记录。 DB50/T1460—2023 4附录A （规范性） 样品培养及保存液配制方法 A.1单个样品保存液配制 10mLDMEM+500μL胎牛血清+1mL100×青霉素-链霉素-两性霉素，混匀后过滤除菌（0.22μm）， 不得高压灭菌。配制完成后于4℃保存，有效使用期不超过21d。 A.2DPBS配制 8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，同时溶解于1LddH2O中。 过滤除菌（0.22μm）或高压灭菌。配制完成后于4℃保存，有效使用期不超过21d。 A.3DMEM（+10%胎牛血清+1×抗生素）配制 500mLDMEM+56mL胎牛血清+5.6mL100×青霉素-链霉素-两性霉素，混匀后过滤除菌（0.22 μm），不得高压灭菌。配制完成后于4℃保存，有效使用期不超过21d。 A.4细胞冷冻液配制 70mLDMEM+20mL胎牛血清+10mLDMSO，混匀后过滤除菌（0.22μm），不得高压灭菌。配 制完成后于4℃保存，有效使用期不超过21d。