! 7 ,     !7,+,0)      ' .   ' 新型冠状病毒检测技术规范 第21部分 ： 污水样本病毒富集浓缩和检测 Technical specifications for SARS⁃CoV⁃ 2 detection —Part 21： Concentration and detection of virus in sewage samples 2023 -07-25 发布 2023 -08-25 实施CCS C 50 DB32/T 3762.21—2023ICS 13.100 DB32/T 3762.21—2023 前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 1 范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义 ………………………………………………………………………………………………… 1 4 检出限与回收率 …………………………………………………………………………………………… 1 5　环境与设施 ………………………………………………………………………………………………… 1 6 设备与耗材 ………………………………………………………………………………………………… 2 7 试剂与材料 ………………………………………………………………………………………………… 2 8 污水样本富集浓缩 ………………………………………………………………………………………… 2 9 核酸检测 …………………………………………………………………………………………………… 3 10 标准曲线的建立 …………………………………………………………………………………………… 3 11 污水新冠病毒浓度定量 …………………………………………………………………………………… 3 12 回收率计算 ………………………………………………………………………………………………… 3 13　质量控制 …………………………………………………………………………………………………… 4 14 结果与报告 ………………………………………………………………………………………………… 4目　 次 Ⅰ DB32/T 3762.21—2023 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件是 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范 》的第 21部分。DB32/T 3762已经发布了以 下部分： ——第1部分：生物样本采集 、运输和保存 ； ——第2部分：病毒分离与鉴定 ； ——第3部分：核酸荧光 PCR检测程序 ； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序 ； ——第5部分：血清 IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序 ； ——第6部分：血清 IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序 ； ——第7部分：空气样本检测与评估 ； ——第8部分：物体表面检测与评估 ； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估 ； ——第10部分：微量血清中和试验 ； ——第11部分：全基因组高通量测序 ； ——第12部分：药物体外抗病毒效果测定 ； ——第13部分：叠氮溴化丙锭 -荧光 PCR检测程序 ； ——第14部分：N亚基因组荧光 PCR检测程序 ； ——第15部分：血清 /血浆 IgM和IgG抗体磁微粒化学发光法检测程序 ； ——第16部分：核酸数字 PCR法； ——第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品 ； ——第18部分：规模化核酸检测程序 ； ——第19部分：全自动核酸快速一体化检测 ； ——第20部分：核酸荧光 PCR检测质量控制 ； ——第21部分：污水样本病毒富集浓缩和检测 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由江苏省卫生标准化技术委员会提出并归口 。 本文件起草单位 ：江苏省疾病预防控制中心 、北京大学分子工程苏南研究院 、苏州市疾病预防控制中 心、无锡市疾病预防控制中心 、扬州市疾病预防控制中心 、常熟市疾病预防控制中心 、未名环境分子诊断 （常熟）有限公司 、南京医科大学 。 本文件主要起草人 ：丁震、周波、彭世富、李喜青、郑浩、张瑜、沈强、肖勇、徐勤、周正元、冯微宏、袁轩、 管红霞、李鑫娜、龚利强、朱宝立、徐燕、朱媛园、王蕊。 Ⅲ DB32/T 3762.21—2023 新型冠状病毒检测技术规范 第21部分： 污水样本病毒富集浓缩和检测 1 范围 本文件规定了污水样本中新型冠状病毒富集浓缩和检测方法 。 本文件适用于生活 、医疗、商业和工业等污水样本中的新型冠状病毒的浓缩富集和检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 WS/T 799—2022　污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件 。 3.1 裂解法 pyrolysis method 利用裂解盐使污水中病毒核酸与蛋白分离 ，高盐条件下的污水通过滤膜 ，其核酸样本被膜吸附 ，完成 富集过程 ，利用低盐条件将吸附的核酸样本从膜上洗脱 ，再进行后续检测分析 。 3.2 回收率 recovery efficiency 浓缩富集后回收样本的总拷贝数与原污水样品中接种的病毒总拷贝数之比 。 4 检出限与回收率 富集浓缩采用裂解法时 ，方法的检出限为 1 copy/mL ，N靶标的回收率为 16%~ 65%，ORF 1ab靶标 的回收率为 10%~ 48%。 5　环境与设施 富集浓缩和检测等操作应在生物安全二级实验室 （BSL⁃ 2）进行，同时采用不低于生物安全三级实验 室的个人防护 。实验过程中产生的所有废弃物 （包括剩余水样 ）均应经有效灭菌后再按医疗废弃物进行 分类处理 。新冠病毒核酸检测实验室应满足 GB 19489。 1 DB32/T 3762.21—2023 6 设备与耗材 6.1 设备 生物安全柜 、移液器（10 μL、50 μL、200 μL、1 mL） 、电动移液器 、冷冻离心机 （4 ℃、2 mL 转子） 、pH 计（精度 ≥0.01） 、水浴锅、多孔真空抽滤装置 、滚轴摇匀仪 、电子天平 （分辨力不低于 0.001 g） 、实时荧光 定量 PCR仪或数字 PCR仪。 6.2 耗材 N95及以上防护口罩 、医用无纺布帽 、护目镜、连体防护服 、一次性 PE手套、一次性手术衣 、乳胶手 套、防水靴套 。 7 试剂与材料 7.1 试剂 氯化钠（NaCl，分子生物学级 ） 、无核酸酶水 （分子生物学级 ） 、乙醇（70%） 、TE缓冲液（1 mol/L Tris ， 100 mmol/L EDTA ） （配制方法 ：称取 12.11 g三羟甲基氨基甲烷 （Tris，纯度 ≥99%） ，3.36 g乙二胺四乙 酸二钠（纯度 ≥99%） ，置于烧杯中 ，加入 70 mL水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中 ，用盐酸将 pH调至 7.2， 定容至 100 mL） 。 7.2 材料 无菌锥形瓶 （100 mL）、无菌无核酸酶带盖离心管 （50 mL）、无菌无核酸酶移液器吸头 （10 μL、 200 μL、1 mL，带滤芯） 、一次性玻璃纤维膜 （1 μm） 、无菌注射器 （50 mL） 、核酸富集柱 、无菌无核酸酶带盖 离心管（1.5 mL） 、增量管（25 mL） 注： 其他材料参照所用病毒核酸提取 、扩增试剂盒 。 8 污水样本富集浓缩 8.1 样本灭活 样本灭活按照 WS/T 799—2022中第 6章执行。 8.2 预过滤 用大容量电动移液器移取 40 mL灭活后的污水样本于 50 mL无菌离心管中 ，加入 9.35 g NaCl 和 400 μL TE缓冲液，使用滚轴摇匀仪震荡混合 ，直至 NaCl固体完全溶解 。多孔真空抽滤装置上依次接 1 μm玻璃纤维膜和 50 mL注射器套管 ，无菌锥形瓶放置于真空抽滤装置内对应位置 。打开真空泵 ，在负 压条件下将上述样品过滤收集到无菌锥形瓶中 。关掉真空泵 ，打开阀门释放压力 ，取出锥形瓶 ，在滤液中 加入 40 mL 70%乙醇，振荡摇匀 ，室温静置 5 min。 注： 未配备多孔真空抽滤装置的实验室可使用常规固相萃取装置代替 ，完成预过滤和富集浓缩步骤 ；未配备滚轴摇匀 仪的实验室可手动摇匀 ，促进 NaCl固体的溶解 。 2 DB32/T 3762.21—2023 8.3 富集浓缩 多孔真空抽滤装置上依次连接核酸富集柱 、增量管。打开真空泵 ，形成负压 。将滤液与乙醇混合样 混匀后，倒入增量管中 ，通过核酸富集柱完成浓缩步骤 。 注： 如污水样品较为浑浊 ，过滤速度慢或发生堵塞 ，可使用新的核酸富集柱进行替换 ，完成富集过程 ，同一污水样本所 有的核酸富集柱的洗脱液作为该污水样本的浓缩液 。 8.4 洗脱 待样品浓缩完成后 ，关掉真空泵 ，打开阀门释放压力 ，回收核酸富集柱 。核酸富集柱置入配套离心管 中，将无核酸酶水加入到柱膜中间 ，静置 3 min~ 5 min后，4 ℃条件下 12 000 r/min离心 1 min，收