ICS 65.020 CCS B 16 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3149—2023 油菜菌核病菌对甾醇脱甲基抑制剂类杀菌 剂的抗药性检测技术规程 Technical code of practice for detecting sterol demethylation inhibitor fungicide resistance of sclerotinia sclerotiorum isolated from oilseed rape 2023-08-25发布 2023-09-25实施 内蒙古自治区市场监督管理 局 发布 DB15/T 3149 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（ SAM/TC 20 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、呼伦贝尔农垦集团特泥河农牧场有限公司、赤峰市 农牧业综合检验检测中心。 本文件主要起草人：杨永青、赵丽丽、李子钦、宋培玲、皇甫海燕、燕孟娇、贾晓清、郭晨、皇甫 九茹、张英、郝贵宾、刘铭、霍宏丽。 DB15/T 3149 —2023 1 油菜菌核病菌对甾醇脱甲基抑制剂类 杀菌剂的抗药性检测技术 规程 1 范围 本文件规定了油菜菌核病菌（ Sclerotinia sclerotiorum ）对甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂的抗药性 检测的技术要求，主要包括样品采集、纯化及保存、抗药性检测方法、抗药性评价。 本文件适 用于油菜菌核病菌对苯醚甲环唑、戊唑醇、咪鲜胺的抗药性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1667.3 农药登记管理术语 第3部分：农药药效 NY/T 1859.1 农药抗性风险评估 第1部分：总则 NY/T 1859.6 农药抗性风险评估 第6部分：灰霉病菌抗药性风险评估 SN/T 2589 植物病原真菌检测规范 3 术语和定义 NY/T 1667.3 、NY/T 1859.1 和NY/T 1859.6 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 有效中浓度 median effective concentration,EC 50 能使某生物群体半数产生某种药剂反应所需的药剂浓度。 植物病原菌抗药性 fungicide resistance 本来对农药敏感的野生型植物病原菌个体或群体，由于遗传变异而对药剂出现敏感性下降的现 象。 3.3 抗药性检测 detection for resistance 通过常规的生物测定手段判断病原群体 中是否存在抗药性菌株及抗药菌株的出现频率。 4 主要试剂 DB15/T 3149 —2023 2 供试杀菌剂 苯醚甲环唑（ Difenoconazole ）、戊唑醇（ Tebuconazole ）、咪鲜胺（ Prochloraz ），药剂为原药。 化学试剂 葡萄糖、琼脂粉、吐温 -80、次氯酸钠、无水乙醇、二甲基亚砜（ DMSO）均为国产分析纯试剂。 5 含药培养基的配制 将原药溶解于二甲基亚砜（ DMSO）中，制成浓度为 10 mg/mL 的母液，用已灭菌的 0.05%吐温-80稀 释成工作液，将配制好的工作液加入已灭菌、冷却至 45 ℃～50 ℃的PDA培养基中，倒平板，每皿 20 mL培养基，制成系列浓度梯度的含药培养基。 培养基中农药的终浓度及加入体积参见附录 A中表A.1，加药体积计算方法参见附录 B。母液和工 作液现用现配。 6 样品采集、纯化和保存 样品采集 在油菜菌核病发生田块中按照随机取样法采样，样本间隔距离不低于 30 m，同一病株上采集的多 个菌核为同一份样品，如果病原群体中抗性产生情况未知，一般需采集 60～100份菌株样本。菌核样本 采集后装入纱网袋或纸袋中，记录采样地点和时间。 样品的纯化 按照SN/T 2589 ，采用组织分离法对菌核样品进行纯化，菌核表面消毒后置于马铃薯葡萄糖琼脂培 养基（PDA）上，25 ℃ 黑暗培养。 待菌核萌发出菌丝后，从培养皿中菌落的边缘挑取少量菌丝转接至 PDA培养基上进行纯化培养， 纯 化2～3代后，且能够在培养基上产生黑色菌核的确定为菌核病菌，分别用“年份 -采样地-序号”进行 编号。 菌种保存 菌核病菌的保存方法可将菌核收集、自然晾干，保存于纸袋或纱网袋中，置于阴凉干燥处；或在长 满菌丝的 PDA培养基3/4处，用打孔器制成直径为 5 mm的菌丝块，装入 1.5 mL的无菌离心管或菌种 保存管中 （4～8个菌丝块 /管），用无菌水浸没，拧紧管盖并用封口膜密封，常温可保存 6～12个月。 7 抗药性检测方法 室内敏感性测定 打取上述已纯化的核盘菌菌块转接到 PDA平板上进行培养。待菌落长到 3/4培养皿时，在菌落的边 缘用直径 5 mm打孔器打取相同菌龄的菌块，菌面向下置于系列浓度梯度的含药 PDA培养基中央，以加 入相同体积的 0.05%吐温-80为对照， 25 ℃黑暗培养 2 d后，采用十字交叉法测量菌落直径（ mm），每 个浓度设置 3次重复。 DB15/T 3149 —2023 3 有效中浓度（ EC50）的计算 用7.1中菌落直径的平均 值（mm），根据公式（ 1）计算菌丝生长抑制率： IR=D1−D2 D1−D3×100 ………………………………………（ 1） 式中： IR——为菌丝生长抑制率，单位 %； D1——为照菌落直径 ，单位mm； D2——为含药处理菌落直径，单位 mm； D3——为菌块直径，单位 mm。 菌丝生长抑制率转换的机率值为 y，杀菌剂浓度的对数值（ log10）为x，根据 x与 y的线性关系得 出其毒力回归方程 y=ax+b，计算抑制率为 50%时对应的 x值，再计算 10x所对应的浓度值，即为有效中 浓度 EC50值（μg/mL）。 8 抗药性评价 敏感基线的建立 按照NY/T 1859.6 标准中的方法建立敏感基线。 抗性指数 杀菌剂施用一定时间后，若出现田间防效下降，可通过测定供试菌株的 EC50值，根据公式（ 2）计算 出抗性指数（ resistance factor, RF ），RF的大小反映供试菌株的抗药性水平。 RF= E1 E2×100 ………………………………………（ 2） 式中： RF——为抗性指数，单位 %； E1——为供试菌株的 EC50 值，单位μg/mL； E2——为敏感菌株平均 EC50值，单位μg/mL。 抗药性菌株的判定 根据供试菌株的抗性指数判定其抗性水平，不同药剂的判定标准见表 1。 表1 不同药剂的抗药性菌株判定标准 杀菌剂名称 敏感菌株 低抗菌株 中抗菌株 高抗菌株 参考文献 戊唑醇 抗性指数＜ 3 3≤抗性指数＜10 10≤抗性指数＜100 抗性指数≥100 [2] 咪鲜胺 抗性指数＜ 3 3≤抗性指数＜10 10≤抗性指数＜100 抗性指数≥100 [3] 苯醚甲环唑 抗性指数＜ 5 5≤抗性指数＜10 10≤抗性指数＜100 抗性指数≥100 [4] 抗性频率 根据公式（ 3）计算抗性频率，能够反映病原菌群体中抗药性菌株出现频率。 DB15/T 3149 —2023 4 X=N1 N2×100 ………………………………………（ 3） 式中： X——为抗性频率，单位 %； N1——为抗药性菌株的数量 ，单位株； N2——为供试菌株的总数 ，单位株； 计算结果保留小数点后 2位。