ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3151—2023 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其 RNA提取技术规程 Technical procedures for preparation by enzyme digestion method and RNA extraction of bovine mammary epithelial cells 2023-08-25发布 2023-09-25实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3151 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：宋洁、王丽芳、胡耀、张腾龙、郭晨阳、钟华晨、刘嘉琳、杨健、狄彩霞、羿 静、肖豆鑫、吴海霞、王春和、田志国、王利平、高新发、王晓辉、常月明、杨竹鸣、石文奎、褚文彬、 马跃。 DB15/T 3151 —2023 1 酶消化法制备奶牛乳腺上皮细胞及其 RNA提取技术规程 1 范围 本文件规定了奶牛乳腺上皮细胞培养及其 RNA提取和质量鉴定的方法。 本文件适用于Ⅱ型胶原酶法制备奶牛乳腺上皮细胞及其 RNA提取和质量鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 奶牛乳腺上皮细胞 bovine mammary epithelial cells 奶牛乳腺组织中唯一可以合成和分泌乳汁的高度分化的功能细胞。 角蛋白-18 cytokeratin18 （CK18） 上皮细胞特有的标志蛋白。 4 试剂和材料 试验试剂 DMEM/F12 培养基、胎牛血清（ FBS）、青链霉素混合液（含有 10000 unit/mL 青霉素和 10000 ug/mL 链霉素）、胰岛素转铁蛋白硒、氢化可的松、两性霉素 B、表皮生长因子、胶原酶Ⅱ、 0.25%胰蛋白酶、 二甲基亚砜（ DMSO）、磷酸盐缓冲液（ PBS）、75%酒精、4%多聚甲醛、 0.3%曲拉通（ TritonX－100）、 5 %正常山羊血清、兔抗角蛋白 18抗体、山羊抗兔 IgG、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（ DAPI）、甘油、 TRNzol 裂解液、氯仿、异丙醇、无水乙醇、 ddH2O、西班牙琼脂糖、 50×TAE、DNA片段标准参照物（ DNA Marker DL 5000）、通用电泳加样缓冲液（ 6×Loading Buffer ）、核酸染料、反转录试剂盒、实时荧光定量（ RT- PCR）试剂盒。 试剂配制 4.2.1 3×PBS缓冲液： 1×PBS缓冲液（ 500 mL）中加入 3 mL青链霉素混合液， 4 ℃低温保存。 4.2.2 6×PBS缓冲液： 1×PBS缓冲液（ 500 mL）中加入 6 mL青链霉素混合液， 4 ℃低温保存。 DB15/T 3151 —2023 2 4.2.3 Ⅱ型胶原酶（ 0.5%）： 称取 75 mgⅡ型胶原酶，在灭菌烧杯中加 15 mL PBS缓慢吹打溶解， 0.22 μm针式过滤器过滤，现配现用。 4.2.4 氢化可的松（ 0.1 mg/mL ）：1 mg氢化可的松溶于 1 mL乙醇溶液中，充分混匀至粉末完全溶解， 用1×PBS定容至10 mL，用0.22 μm滤膜过滤后，按每管 1 mL分装，封口冻存于 -20 ℃。 4.2.5 两性霉素 B（2.5 mg/mL ）： 25 mg两性霉素 B 粉末溶于 10 mL三蒸水中，吹打溶解后用 0.22 μm 针式过滤器过滤，按每管 1 mL分装，封口冻存于 -20 ℃。 4.2.6 表皮生长因子（ 10 μg/mL）：将 0.1 mg 的表皮生长因子溶解 在 10 mL 的 PBS 中，按每管 1 mL分装，封口冻存于 -20 ℃。 4.2.7 完全培养基：将 90 mL DMEM/F12 培养基、 10 mL FBS 、4 mL青链霉素、 0.5 mL胰岛素转铁蛋白 硒、0.1 mL氢化可的松（ 4.2.4）、0.1 mL两性霉素 B（4.2.5）、10 μL表皮生长因子（ 4.2.6）加入 250 mL蓝盖瓶，混匀后 4 ℃保存。 4.2.8 消化终止培养基： 8 mL DMEM/F12 培养基中加入 2 mL FBS 混匀，现配现用。 4.2.9 细胞冻存液： 8 mL DMEM/F12 培养基中加入 1 mL FBS 、1 mL DMSO混匀，现配现用。 4.2.10 1×TAE：1 mL 50×TAE加49 mL ddH2O ，定容后混匀。 4.2.11 琼脂糖凝胶 （ 1%）：250 mL三角瓶中称 0.3000 g 琼脂糖， 加入 30 mL 1×TAE缓冲液 （4.2.10）。 4.2.12 琼脂糖凝胶 （ 2%）：250 mL三角瓶中称 0.6000 g 琼脂糖， 加入 30 mL 1×TAE缓冲液 （4.2.10）。 试验材料 酒精灯、 0.22 μm针式过滤器、 25 cm2透气细胞培养瓶、 6孔细胞培养板、瓷盘、 15 cm镊子、眼科 镊、眼科剪、手术剪、 5 mL无菌无酶样品管、 15 mL无菌无酶离心管、 1.5 mL无菌无酶离心管、 250 mL 烧杯、250 mL蓝盖瓶、细胞冻存管、 80目滤网、 14 mm无菌细胞爬片、载玻片、无菌无酶枪头（ 10 μL、 200μL、1 mL、5 mL）。 仪器设备 天平（感量为 0.0001 g ）、生物安全柜、 CO2培养箱、高压蒸汽灭菌锅、倒置显微镜、低速离心机 （转速不低于 1300 rpm ）、高速冷冻离心机（转速不低于 12000 rpm ）、4 ℃冰箱、 -80 ℃冰箱、酶标 仪、凝胶成像仪、电泳仪、电泳槽、制胶板、移液枪、血细胞计数板。 5 奶牛乳腺上皮细胞培养 原代培养 5.1.1 选取健康奶牛活体或屠宰后，采集色泽亮白的深层乳腺组织，迅速带回实验室。 5.1.2 将乳腺组织置于已用 75%酒精擦拭消毒的搪瓷盘中，去除乳腺表层组织，避开泌乳导管和结缔 组织部位，剪取 1 cm3左右的深层腺泡，置于 6×PBS缓冲液（ 4.2.2）中浸泡 10 min，并清洗至溶液中 无乳汁后，放入超净台。 5.1.3 在超净台中点燃酒精灯，依次摆放 7个250 mL灭菌烧杯，从左往右分别倒入 3杯150 mL 3 × PBS缓冲液、 1杯75%酒精、3杯3×PBS缓冲液（ 4.2.1）。 5.1.4 用灭菌长柄镊子夹取组织块，按序在 7个烧杯中清洗 30 s后转移至无菌一次性培养皿中。 5.1.5 在培养皿中再次剪去乳腺组织块表皮，剪取约 2 mL组织块（ 1-2 mm3/块）至于 5 mL样品管中， 用眼科剪将组织块剪至糊状。 5.1.6 加入等量 0.5%Ⅱ型胶原酶（ 4.2.3），颠倒混匀，放入 37 ℃恒温培养箱中消化 1 h。 5.1.7 消化结束后，于 80目滤网上过滤消化液，并将滤液转移到 15 mL离心管中， 1300 rpm 离心3 DB15/T 3151 —2023 3 min。弃上清，用 5 mL 3×PBS缓冲液重悬， 1300 rpm 离心3 min，重复1～2次。 5.1.8 细胞沉淀中加入 5 mL完全培养基（ 4.2.7），吹散后移入 25 cm2 细胞培养瓶里，置于 5% CO 2、 37 ℃恒温培养箱中培养。 5.1.9 培养第 5 天，取出培养瓶在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，贴壁后更换完全培养基，此后每 2天换一次液。 传代培养 5.2.1 倒置显微镜下观察细胞长满至 80%以上后取出，弃上清，加入 5 mL 3×PBS清洗。 5.2.2 加入1 mL 0.25% 胰蛋白酶，轻轻摇晃 30 s～60 s，弃上清，加入 5 mL 3×PBS清洗一次，去除 成纤维细胞。 5.2.3 再加入2 mL 0.25% 胰蛋白酶后放入 37 ℃恒温培养箱中消化 8 mim，显微镜下观察细胞脱壁呈 亮圆点时，加入 2 mL终止培养基（ 4.2.8）终止消化。 5.2.4 轻柔吹打培养瓶底后转移至 15 mL离心管中， 1300 rpm 离心3 min。 5.2.5 弃上清，加入 5 mL 3×PBS缓冲液重悬， 1300 rpm 离心3 min。 5.2.6 弃上清， 在细胞沉淀中加入 5 mL完全培养基吹打混匀， 移入 25 cm2细胞培养瓶里， 置于 5% CO 2、 37 ℃恒温培养箱中培养。 冻存 将传代后的细胞进行冻存。将细胞用 0.25%胰蛋白酶消化 8 min，3×PBS洗涤并离心后，加入 1 mL细 胞冻存液（ 4.2.9），封口后置于细胞冻存盒中，迅速冻存于 -80 ℃。 复苏 5.4.1 使用细胞时，将细胞从 -80 ℃冰箱取出，并迅速（ 90 s内）在 37 ℃水浴锅中晃动融化，再转 移到15 mL离心管中，加入 1 mL完全培养基， 1300 rpm 3 min 离心获得细胞沉淀。 5.4.2