ICS 67.120.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7210-2011 鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法 Method for detection of Anisakis simplex larva in fish 行业标准信息服务平台 2011~12-01实施 2011-09-01 发布 中华人民共和国农业部发布 SC/T 7210—2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准主要起草单位：中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。 本标准主要起草人：吴山功、王桂堂、孙喜模、陈爱平、姚卫建、朱泽闻。 行业标准信息服务平台 I SC/T 7210—2011 鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法 1 范围 本标准规定了简单异尖线虫（Anisakissimplec）幼虫形态学鉴定和聚合酶链式反应（PCR)检测方 法。 本标准适用于鱼类简单异尖线虫幼虫的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18088出人境动物检疫采样 3试剂和溶液 除另有说明外，所有试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682中一级水的指标。 3.1生理盐水：0.85g氯化钠溶于100mL蒸馏水中，室温保存。 3.2巴氏液：0.85g氯化钠和3mL甲醛溶液溶于97mL蒸馏水中，室温保存。 3.310%的甘油酒精：10mL甘油溶于90mL70%的酒精中，室温保存。 3.4乙醇：70%、80%的乙醇以及无水乙醇。 3.5乳酸酚透明液：按甘油：苯酚：乳酸：蒸馏水的体积比2：1：1：1的比例配置，室温保存。 3.6TE:10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)1 mmol/L EDTA(pH 8.0),在 1.05kg/ cm²高压下蒸汽灭菌 20min，于4℃贮存。 3.710%SDS溶液：10gSDS溶于90mL蒸馏水中，68℃助溶，调pH至7.2，最后加水定容至 100mL，室温保存。 3.8抽提缓冲液I：400uLTE、16μL蛋白酶K(5mg/mL)和20μL10%SDS的混合溶液。 4℃保存。 3. 10 MgCl2 :25. 0 mmol/ L 3.11TAE缓冲溶液：按Tris碱4.84g、冰乙酸1.142mL和Na2EDTA·2HzO0.744mL加水定容到 1 000 mL。 3.121.0%琼脂糖：琼脂糖1g溶于100mLTAE中。 3.13Taq酶：一20℃保存，避免反复冻融。 3.14蛋白酶K：一20℃保存，避免反复冻融。 3. 15 dNTPs:含 dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各 10 mmol/L 3. 16 10 XPCR buffer:500. 0 mmol/ L pH8. 8 的 Tris-HCI,500. 0 mmol/ L 的 KCI 和 1%的 TritonX 100混合溶液。 3.17矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。 3.18分子量标准：推荐使用DL2000marker，4℃保存；长期贮存应分装置于一20℃，避免反复冻融。 1 SC/T 7210-2011 3.19溴酚蓝指示剂溶液：溴酚蓝100mg，双蒸水5mL，室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双 蒸水溶解后与溴酚蓝溶液混合，摇匀后定容至50mL，加人NaOH调至蓝色。 4仪器和设备 4.1电子天平。 4.2剪刀、镊子、昆虫针和手术刀。 4.3体视显微镜及普通光学显微镜。 4.4酒精灯。 4.5培养皿。 4.6普通台式离心机和高速冷冻离心机。 4.7普通冰箱和超低温冰箱。 4.8微量移液器和Tip头。 4.9PCR扩增仪。 4.10离心管和PCR管。 4.11紫外透射仪。 4.12水平电泳仪。 5寄生虫分离和固定 5.1分离 按GB/T18088的标准采样抽样检查。从鱼腹腔、胃、肠系膜、肝脏、生殖腺、肌肉等组织中分离虫 体。 5.2固定 将虫体置于有生理盐水的培养皿中，然后将部分虫体置于巴氏液中固定用于形态学观察；部分虫体 置于80%的乙醇溶液中用于后续分子生物学检测。 6形态鉴定 6.1样品处理 将用巴氏液固定的虫体取出后置于10%的甘油酒精中透明，在显微镜下观察其形态特征；对于透 明不好的结构，用乳酸酚透明液透明后再观察形态特征。 6.2形态特征 幼虫活体呈乳白色、半透明，在生理盐水中时而卷曲呈盘状，时而如蚯蚓样蠕动。虫体长圆筒形，两 端略细，体长10mm～30mm。前端钝圆，口唇尚未发育完全，无间唇，排泄孔位于两亚腹唇间。头部顶 端有一钻孔齿，平均高10.5μm。食道为肌肉质，中间较细，前端和后端均膨大。神经环位于食道前端 约1/7距离处。食道之后是腺体胃，胃长圆筒形，黑色不透明（活体时胃呈乳白色），长为宽的3倍～5 倍，腺胃与中肠交接处分界线明显。肠管粗大，直肠明显，尾部很短，末端圆钝。无胃盲囊和肠盲囊。性 腺未发育（参见附录A)。简单异尖线虫食道椭圆形（obling)，通常呈S形，长度超过宽度，交合刺超过 0.7mm，长交合刺长度很少超过短交合刺的2倍，比例大约是1：1.6。 7分子生物学检测法 7.1DNA的提取 取80%酒精溶液保存的异尖线虫样品放人1.5mL的离心管中，加人1mL的TE(pH8.0)室温浸 2 SC/T 7210—-2011 泡过夜。移除TE，再加人500μL抽提缓冲液I于55℃消化3h，4℃放置至室温后加人500μL抽提缓 冲液Ⅱ，摇匀，轻缓摇动10min，11000g离心10min，收集上清。加人500μL抽提缓冲液Ⅱ重复抽提两 次，然后加人2倍上清体积的0℃无水乙醇于一20℃放置1h。5000g离心10min收集沉淀，70%乙醇 洗涤沉淀两次，干燥后溶于40uLTE（pH8.0)，一20℃保存备用。 7.228S 和 ITS rDNA 的 PCR 扩增 7.2.1 引物 TCA - AGA - CGG-G- 3' ACC- AGC- TAC- TA -3' 引物 93,5'-TTG-AAC-CGG-GTA-AAA-GTC-G-3'和 94,5'-TTA-GTT-TCT- TTT - CCT - CCG - CT - 3' 区2和5.8S亚单位序列。 7.2. 2PCR 扩增 dNTPs,2.5μL 25mmol/ L的 MgCl2,2.5 μL 10XPCR buffer,0.2 U DNA Taq酶以及模板基因组 DNA1μL，最后用水定容到25μL。PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃ 1min,35个循环；72℃延伸8min,PCR反应同时做阴性对照和阳性对照。 7.3PCR产物电泳与测序 取5μLPCR产物加人1μL溴酚蓝指示剂溶液，混匀，用1.0%琼脂糖于TAE缓冲溶液中电泳分 离，紫外透射仪下检查是否存在大约1000bp和800bp～1100bp(28SrDNA：391与390引物对约800 bp;538与501引物对约1100bp)的目的条带。 存在目的条带,则取PCR扩增产物测序。得到的序列与GenBank数据库中的参考序列进行比对， 参考序列Asimplex的28SrDNA（AY821754和AY821755)和ITSrDNA（AY821739)见附录B。 8结果判定 8.1虫体形态特征符合7.2描述的，判定为简单异尖线虫幼虫。 8.2PCR扩增产物测序，序列与参考序列（参见附录B)进行比较,序列相似性在98%以上者，判定虫 体为简单异尖线虫幼虫。 符合上述结果之一者判定为简单异尖线虫幼虫。 行业标准信息服务平台 3 SC/T 7210-2011 附录A (资料性附录） 简单异尖线虫形态结构 M 0.2 mm 说明： V—胃(Ventriculus); T—钻齿(Boring tooth); 肠盲囊(Intestinal cecum); Om—食道肌(Oesophageal musle); 肠管（Intestine)； Ep——排泄孔(Excretory pore); Ag- 侧尾腺(Aside caudal gland); Nr——神经环(Nerve ring); M- 尾棘(Mucron)。 行业标准信息服务平 平台 4 SC/T 7210—2011 附录B （资料性附录） 简单异尖线虫核酸序列 B. 1 2 28 S rDNA序列 AY821755（|物：391和390) 1 AAAGAAACTA ACGAGGATTC CCATAGTAAC GGCGAGTGAA ATGGGAAAAG CCCAGCGCTG 121 CGTGCACCCA AAGTCCCCTT GAGCGGGGCC ATAGTCCAAA GAAGGTGCTA GACCTGTACG 301 CCGTGAGGGA AAGTTGCAAA GAACTTTGAA GAGAGAGTTC AAGAGGGCGT GAAACCGCCG 361 AGATTGAAAC GGATAGAGTT GACGAAACTC GATCGCATTC ATCCGATCCG CCTAGCGGTT 421 CGGCGGTTGT TGACTTCCTC GATGAGGGCA ACGCCGTCGC TGGCTGTTGG GTGTTAGATG 4