ICS 11.220 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7211—2011 传染性脾肾坏死病毒检测方法 Detection method of infectious spleen and kidney necrosis virus 行业标准信息服务平台 2011-09-01发布 2011-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T 7211—2011 言 本标准按GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。 本标准由中华人民共和国农业部全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所、中山大学。 本标准主要起草人：潘厚军、何建国、吴淑勤、翁少萍、董传甫、付小哲、石存斌。 行业标准信息服务平台 I SC/T 7211—2011 传染性脾肾坏死病毒检测方法 1 范围 本标准规定了采用间接荧光抗体技术(IFAT)和聚合酶链式反应技术（PCR)检测传染性脾肾坏死 病毒(ISKNV)的方法。 本标准适应于传染性脾肾坏死病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 本标准可检测包含ISKNV在内的肿大细胞病毒属病毒，包括真鲷虹彩病毒(RSIV)、条石鲷虹彩病 毒(RBIV)、斜带石斑鱼虹彩病毒(OSGIV)等；但不能检测虹彩病毒科其他属病毒。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7014水生动物检疫实验技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 传染性脾肾坏死病毒ISKNV,infectious spleen and kidney necrosis virus 传染性脾肾坏死病毒是虹彩病毒科肿大细胞病毒属的代表种。该病毒为一种胞质型双链 DNA病 毒，呈二十面体对称结构，病毒颗粒直径约150nm，基因组大小111032bp。该病毒感染敏感细胞，可引 起一定程度的皱缩、坏死等细胞病变(CPE)；感染和多种海、淡水养殖鱼类，引起脾脏和肾脏肿大、坏 死，鳃发白、呈缺血状的淡红色，肝脏苍白等症状。 该病毒的主衣壳蛋白（MCP，majorcapsidprotein）是高丰度结构蛋白，约占ISKNV蛋白总量的 40%。虹彩病毒MCP基因具有高度的保守性，是虹彩病毒进行系统分类的主要依据。MCP基因也是 对虹彩病毒进行分子诊断的常用靶基因。 4试剂和材料 4.1水 符合GB/T6682中一级水的要求。 4. 2ISKNV 参考株和 ISKNV 的 DNA 由有资质的动物病原微生物菌（毒)种保藏机构提供。 4.3敏感细胞株 仔鱼细胞系（MFF-1)或其他敏感细胞系、株，由有资质的实验室提供。 4.4 Mab(2D8) 抗ISKNV单克隆抗体，由有资质的实验室提供，一20℃保存。 4.5FITC标记的羊抗鼠IgG 商品化试剂，20℃保存。 1 SC/T 7211—2011 4.6基因组DNA提取试剂盒 商品化试剂盒，按说明书要求保存。 4.7Taq酶 一20℃保存，避免温度剧烈变化。 4.8 dNTP 一20℃保存,含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各 10 mmol/L。 4.9引物 一20℃保存。其序列如下：上游引物F：5'-CGTGAGACCGTGCGTAGT-3；下游引物R：5' AGGGTG ACG GTCGAT ATG-3'。使用时浓度均为20μmoL/L。 4.10DNA分子量标准(Marker) 推荐使用DL2000,各片段大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。也可使 用DNAladder100,各片段大小依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400 bp、300 bp、200 bp 和 100 bp。 4.11核酸凝胶染色剂 溴化乙啶(EB)或其他EB替代品。 4.12甲醇 分析纯试剂，使用前预冷到一20℃。 4.13无水乙醇 分析纯试剂。 4.14其他试剂 见附录 A。 5仪器、设备和器材 5.11 倒置显微镜、荧光显微镜或倒置荧光显微镜。 5.2生化培养箱。 5.3普通冰箱和超低温冰箱。 5.4PCR扩增仪。 5.5离心机和离心管。 5.6电泳仪和水平电泳槽。 5.7紫外观察灯或凝胶成像仪。 5.8组织研磨器。 5.9漩涡振荡器。 5.1024孔、6孔细胞培养板和25cm²细胞培养瓶。 5.11微量移液器及吸头。 标准信息服务平台 5.12剪刀、镊子、解剖刀等解剖用具。 5.13载玻片、盖玻片。 5.14湿盒。 6样品来源 6.1采样 按GB/T18088的规定执行。如是体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长为4cm～6cm的鱼苗取 2 SC/T 7211—2011 内脏(包括头肾和脾脏），体长大于6cm的鱼则取头肾、脾脏和心脏等组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。 样品分成3份进行处理，1份制作组织印片，用于无细胞培养的IFAT检测；1份制作组织样品匀浆 液，用于感染敏感细胞分离病毒1份进行DNA抽提，用于PCR检测。 6.2组织印片 用解剖刀将脾、肾等组织横向切开，用镊子夹起，将组织横切面在载玻片上轻轻涂抹数下；滴加冷甲 醇（一20℃)数滴以完全覆盖组织印片处，室温放置3min～5min；自来水冲洗，室温干燥10min。 6.3感染敏感细胞样品前处理 用组织研磨器冰浴中将样品匀浆，再用无血清细胞培养液（A.1,不加血清）按1：10(w/)稀释度 悬浮，加人抗生素，使最终浓度为青霉素200IU/mL、链霉素200μg/mL和两性霉素B0.5μg/mL，于 15℃下孵育2h～4h或6℃下孵育6h～24h。4℃5000r/min离心15min，收集上清液。卵巢液直接 用无血清细胞培养液稀释2倍以上，4℃5000r/min离心取上清液，用于敏感细胞感染检测。含 ISKNV参考株的组织样品，同样处理。 6.4DNA抽提 取待检鱼组织样品或待检细胞，用基因组DNA提取试剂盒抽提，或按6.4.1～6.4.2的方法处理。 6.4.1取100mg鱼组织样品，加1.0mLPBS匀浆后（A.2），取450μL放人1.5mL的离心管，加入 450μLCTAB溶液（A.3)并混匀，25℃放置2h，其间轻柔振荡几次备用。 如果是培养细胞，取450μL细胞悬液，加人450μLCTAB溶液，同样处理。 6.4.2在有样品离心管中加人600μuL抽提液I（A.4），用漩涡震荡器震荡30s。12000r/min离心 10min，小心吸取上层水相（约800μL)于新的1.5mL离心管，加人700μL抽提液ⅡI（A.5），用漩涡震 荡器震荡30s。12000r/min离心10min，小心吸取上层水相（约600μL)于新的2.0mL离心管，加人 1/10体积（60μL)的乙酸钠（A.6），两倍体积的无水乙醇（1200μL），倒置数次混匀后，12000r/min离 心5min；去上清，沉淀中加入70%乙醇，12000r/min离心20min，洗涤沉淀两次；抽吸除去乙醇溶液， 干燥后加入10μL水溶解，用作PCR检测模板。 7 ISKNV 的分离 7.1细胞培养 培养液（A.1)进行传代培养，1瓶可传代3瓶～5瓶。在细胞瓶或细胞板中加细胞培养液，25cm²细胞瓶 加培养液4mL，6孔板每孔加1mL，24孔板接种500uL。细胞浓度为1.0×105个/mL～2.0×10 个/mL。 7.2病毒分离 7.2.1试验准备 7.2.1.1 细胞 按7.1的方法培养，长成致密层的敏感细胞。 7.2.1.2待检组织样品匀浆液 6.3制备的体积比为1：10待检组织样品。准 7.2.1.3阳性对照样品匀浆液 6.3制备的体积比为1：10的ISKNV参考株样品。 7.2.1.4空白对照 仅有敏感细胞，不接种组织样品匀浆液。 7.2.2病毒分离操作 6.3制备的组织匀浆液以1：10、1：100、1：10003个稀释度，接种于24孔或6孔板长满80%的 3 SC/T 7211—2011 敏感细胞单层中，24孔接种500μL，6孔板每孔加1mL；27℃吸附1h后，去除上清液，再加人新鲜的细 胞培养液，置于27℃培养。 阳性对照和待测样品分别接种细胞后，每天用倒置显微镜检查，连续观察7d。空白对照细胞应当 正常。待检上清稀释液的培养出现细胞病变(CPE)，应立即进行鉴定。如阳性对照细胞出现CPE，被检 样品未出现CPE，需盲传两代，同上观察细胞病变。 如果阳性对照未出现CPE，则试验无效，应采用敏感细胞和新的组织样品重新按上述方法进行病 毒学检查。 8病毒的鉴定I：间接荧光抗体试验(IFAT方法） 8.1试验准备 8.1.1待检样品 6.2制备的组织印片，CPE刚开始出现或盲传两代的细胞培养物。 8.1.2阳性对照 感染ISKNV参考株的组织印片或敏感细胞培养物。 8.1.3阴性对照 正常鱼的组织或正常的敏感细胞。 8.1.4一抗 Mab(2D8)，以PBS(A.2)1：100稀释备用。 8.2间接荧光抗体试验操作 （一20℃）室温固定10min，PBS洗涤3次，1min/次。 滴加经1：100稀释的Mab(2D8），37℃湿盒孵育30min，PBS漂洗3次，加人FITC标记的羊抗鼠 IgG（工作浓度参考产品说明）,37℃孵育30min，PBS漂洗3次，pH