ICS 65.150 B 52 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7213—2011 嗜麦芽寡养单胞菌检测方法 Detection methods for stenotrophomonas maltophilia from chanel fish 行业标准信息服务平台 2011-09-01发布 2011-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 SC/T 7213—2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所。 本标准主要起草人：姜兰、赵飞、邹为民、谭爱萍、陆小苕、罗理、王伟利。 行业标准信息服务平台 I SC/T 7213—2011 鲍嗜麦芽寡养单胞菌检测方法 1范围 本标准规定了由嗜麦芽寡养单胞菌（stenotrophomonasmaltophilia）引起的细菌性病害的病原鉴 定方法与结果判定。 本标准适用于斑点叉尾（Ictalurus punctatus）和云斑（Ictalurus nebulosus）分离的嗜麦芽寡养 单胞菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T4789.28--2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T18652一2002致病性嗜水气单胞菌检验方法 SC/T7014一2006水生动物检疫实验技术规范 3试剂、染色液与培养基 检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按GB/T4789.28、GB/T18652或SC/T7014执行；聚 合酶链式反应(PCR)测定用水应符合GB/T6682中一级水的规格，且要用焦炭酸二乙酯（DEPC)处理 水（A.1)，上述未提及的见附录A。 16S rRNA序列扩增引物,P1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',P2:5'-GGTTACCTT GTTACGACTT-3',一20℃保存。 4设备和器械 5 细菌分离与培养 5.1取样 取鱼的肝、肾及病灶组织。 从取样组织中直接分离接种；在无菌环境中将样品置于无菌离心管中，用无菌盐水冲洗并捣碎，然 后分离接种。 5.2分离培养 样品接种在血液琼脂平板（按GB/T4789.28一2003中4.6规定的方法配制），按常规法划线。 28℃培养24h～48h。然后，从中挑取黄、灰或淡黄色的单菌落在普通营养琼脂平板（按GB/T 4789.28—2003中4.7规定的方法配制）进行纯化培养 6革兰氏染色 按GB/T4789.28—2003中2.2的规定执行。 1 SC/T 7213--2011 7生理生化试验 7.1葡萄糖氧化发酵试验(O/F试验）) 按GB/T4789.28一2003中3.1的规定执行。若封口管与开口管的培养基均变黄色，为发酵型细 菌，判断为阳性；否则为非发酵型菌，判断为阴性。 7.2葡萄糖酸盐试验 将待检菌接种于1%葡萄糖酸盐液体培养基中（配制方法见A.2、A.3)，置28℃静置培养24h，加人 绿橙色或红色沉淀为阳性，不变色（仍为蓝色）为阴性。 7.3肌醇发酵试验 将待检菌穿刺接种于肌醇发酵试验培养基（配制方法见A.5），28℃培养，分别在24h、72h、120h 时观察。培养基变黄色为阳性，不变黄色为阴性。 7. 4硫化氢(H2S)试验 按GB/T4789.28一2003中3.14的规定执行。培养基变黑色为阳性，不变黑色为阴性。 7.5吲哚试验 按SC/T7014一2006中表2的吲哚（靛基质)试验的规定执行。培养基变红色为阳性，不变红色为 阴性。 7.6甲基红(M.R)试验 按SC/T7014一2006中表2的甲基红（M.R)试验规定执行。培养基变红色为阳性，不变红色为阴 性。 7.7 乙酰甲基甲醇(V-P)试验 按SC/T7014-2006中表2的乙酰甲基甲醇(V-P)试验规定执行。培养基下层出现红色为阳性， 不出现红色为阴性。 7.8氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对苯二胺的1%水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性， 不变色为阴性。 7.9过氧化氢酶(接触酶)试验 按SC/T7014一2006中表2的接触酶试验的规定执行。有气泡产生为阳性，不产生气泡为阴性。 7.10淀粉水解试验 按SC/T7014一2006中表2的淀粉水解试验规定执行。菌落周围有透明环为阳性，无透明环为阴 性。 7. 11 液化明胶试验 按GB/T4789.28-2003中3.10的规定执行。培养基液化为阳性，不液化为阴性。 7. 12 脂酶(Tween 80)试验 将待检菌接种于脂酶（Tween80)测定培养基平板（配制方法见A.6），28℃培养7d。在细菌生长的 周围有模糊晕圈者为阳性，无模糊晕圈者为阴性。 7.13 DNA 酶试验 将待检菌接种于DNA酶培养基平板（配制方法见A.7)上,28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉 红色晕圈为阳性，无粉红色晕圈为阴性。 7.14精氨酸双水解酶试验 培养基。用灭菌的凡士林油封管，置28℃培养24h。培养基转红色为阳性，不转红色为阴性。 2 SC/T 7213—2011 7.15鸟氨酸脱羧酶试验 按GB/T4789.28—2003中3.12的规定执行。培养基呈紫色为阳性，对照管培养基为黄色。 7.16运动性试验 半固体琼脂按GB/T4789.28--2003中4.30规定的方法配制。把待测菌穿刺接种于半固体琼脂， 28℃～30℃培养24h～48h。若接种细菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；若接 种细菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。 816S rRNA基因的序列测定和同源性分析 8.1DNA提取 8.1.1将5.2分离纯化的待检菌接种于普通营养液体培养基中，以28℃摇床培养24h。 8.1.2取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体。 8.1.3菌体悬浮于500μuLTE缓冲液（pH8.0）（A.9），振荡悬浮，加人50μL10%的SDS溶液 （A.10),10μL20mg/mL的蛋白酶K(A.11),混匀,37℃温育1h。 8.1.4加人100μL5mol/L的NaCl溶液（A.12），充分混匀，再加人100μLCTAB/NaCl溶液 （A.13），混匀，65温育20min。 8.1.5加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1)（A.14），混匀，12000r/min离心5min。 8.1.6取上清液加人等体积的氯仿：异戊醇（24：1)（A.15），混匀，12000r/min离心5min。 8.1.7取上清液，加人1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，10000r/min离心10min；沉淀 用70%酒精洗涤2次，室温晾干。 8.216SrRNA序列扩增 8.2.1在PCR管中加10XPCR缓冲液（无Mg²+)5.0μL,MgCl²（25mmol/L)5.0μL,dNTPs(10 0' N' /n )N (/ ) (/O uL，无菌双蒸水35.5μL。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。如果使用无热盖 的PCR扩增仪，需在反应混合物上覆加2滴矿物油。混匀后3000r/min离心30S。 8.2.2将反应管置于PCR扩增仪，按下列程序进行PCR扩增：94℃预变性2min；94℃变性45s，52℃ 退火1min，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸7min；4℃保温。 8.3琼脂糖凝胶电泳 8.3.1用TAE电泳缓冲液（A.16)配制1%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB或相应浓度的EB替代品）平 板，凝固后放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述6μL样品和2μL漠酚蓝指示剂溶液 （A.17)加人样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。 8.3.2120V电泳约20min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察电泳条带的数量和位置。 8.3.3在长波紫外灯下用刀片切下含有目的条带（约1500bp)的胶块，放入无菌离心管中称重。 8.4PCR扩增产物纯化、测序及序列比对 8.4.1PCR扩增产物纯化 8.4.1.2经漩涡混匀器振荡1min～2min,将离心管在一70℃放置1h，使凝胶完全冻结。 8.4.1.337℃水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡混匀器上振荡1min～2min；14000r/min离心5min。 12 000 r/min离心5min。 3 SC/T 7213—2011 8.4.1.5取上清液加人等体积的氯仿：异戊醇（24：1)（A.15），混匀，12000r/min离心5min。 8.4.1.6向收集的水溶液中加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，置一20℃过 夜或—70℃放置1h～2h。 8.4.1.714000r/min离心10min,弃上清。 8.4.1.8将沉淀的DNA溶于适当体积的TE缓冲液中，置一20℃保存，待测。 8.4.2将8.4.1纯化的PCR扩增产物进行基因序列测定,并与参考序列(附录B)进行比对分析。 9结果判定 9.1菌落形态 普通营养琼脂培养菌落形态：光滑，有光泽，边缘整齐，菌落呈黄、灰或淡黄色。 9.2细菌染色 革兰氏染色阴性，杆状，