ICS65.020.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T7219.6—2015 三代虫病诊断规程 第6部分：小林三代虫病 Protocols for diagnosis of Gyrodactylosis- Part 6: Infection with Gyrodactylus kobayashi 行业标准信息服务平台 2015-02-09发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T7219.6—2015 前言 SC/T7219《三代虫病诊断规程》为系列标准： -第1部分：大西洋鲑三代虫病； 第2部分：皖三代虫病； 一第3部分：鲢三代虫病； 第4部分：中型三代虫病； 第5部分：细锚三代虫病； 第6部分：小林三代虫病； 本部分为SC/T7219的第6部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。 本部分主要起草人：李文祥、王桂堂、邹红、吴山功、陈爱平。 行业标准信息服务平台 1 SC/T7219.6—2015 三代虫病诊断规程 第6部分：小林三代虫病 1范围 本部分规定了小林三代虫病的感染对象与临床症状，小林三代虫（Gyrodactyluskobayashii)的采 集与固定、形态学鉴定和分子检测的方法以及小林三代虫病的综合判定。 本部分适用于鲫的小林三代虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3试剂和材料 3.1水：符合GB/T6682中一级水的规定。 3.2乙醇：分析纯。 3.3Tag酶：20℃保存，避免反复冻融。 3. 4dNTPs:含dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各 10mmol/L。 3.5上游引物：5-TTTCCGTAGGTGAACCT-3'。 3.6下游引物:5-TCCTCCGCTTAGTGATA-3'。 3.7矿物油：不含DNA酶和RNA酶。 3.8 DNA marker 2000:2 000 bp、1 000 bp.750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。 标准信息服务平台 3.9其他试剂见附录A。 4仪器和设备 4.1解剖盘、剪刀、镊子、解剖针、手术刀。 4.2体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。 4.3盖玻片、载玻片、培养皿。 4.4电子天平。 4.5普通台式离心机和高速冷冻离心机。 4.6普通冰箱和超低温冰箱。 4.7微量移液器。 4.8PCR扩增仪。 4.9离心管和PCR管。 4.10紫外透射仪。 4.11水平电泳系统。 1 SC/T 7219.6—2015 5感染对象与临床症状 5.1感染对象 小林三代虫能感染鲫（Carassiusauratusauratus）和东北雅罗鱼（Leuciscuswaleckii）等。 5.2临床症状 小林三代虫主要寄生于体表，病鱼常出现蹭擦池壁、跃出水面的行为；有些病鱼反应迟钝，常在水流 缓慢的地方出现，体表因黏液增多变成淡灰色，背鳍、尾鳍和胸鳍的边缘出现糜烂。 6三代虫采集与固定 6.1病鱼采集 仔细观察待检鱼类的临床症状和行为，捞取具有典型症状的鱼类。采样方法、样品数量、样品封存 和运输应符合SC/T7103的规定。 6.2三代虫样品的收集 6.2.1现场采集 剪取鳍条、鳃丝或刮取部分体表黏液，置于载玻片上。滴加数滴清水，置于体视显微镜下观察。用 解剖针将三代虫从鳍条或鳃丝或体表黏液中分离，用吸管吸出，放在盛有清水的培养血中，每尾病鱼至 少采集成虫10条。 6.2.2固定病鱼中的采集 剪取病鱼鳍条或鳃丝放在载玻片上，逐滴加人自来水浸泡10min，置于体视显微镜下观察。发现三 代虫后，用解部针将虫体分离，放在盛有清水的培养血中；同时，镜检固定病鱼所用容器底部的沉淀物。 如发现有从鱼体脱落的三代虫，用吸管吸出，放在盛有清水的培养血中。 6.3三代虫样品的固定与保存 加一滴清水到载玻片上，用吸管吸取一个虫体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片。用一张滤纸在盖玻 片边缘缓慢吸水，直到水基本吸干为止。加上一滴APG溶液（见附录A.1)到盖玻片边缘，直到浸满盖 玻片与载玻片之间的空隙。 用于形态学鉴定的虫体样本可用70%酒精保存，用于PCR鉴定的虫体样品可用95%酒精保存。 7小林三代虫的鉴定V 7.1小林三代虫的形态学鉴定 小林三代虫运动如尺；虫体呈长叶形，体长0.3mm～0.7mm，体前有2个头器，无黑色眼点；虫 体后端具几丁质的伞状后吸器，其上有1对锚钩、16个边缘小钩和1根腹联结片；锚钩钩尖较长，长于 基部，腹联结片的耳状突起短而钝，突起间长小于腹联结片长，边缘小钩的钩尖较平直，可依次进行鉴 定。 小林三代虫后吸器的锚钩、边缘小钩和腹联结片的形态特征、测量部位及其大小见附录B。如果虫 体后吸器的形态特征和测量大小与附录B相符，则可判定为小林三代虫。 7.2小林三代虫的分子检测 7.2.1虫体DNA的提取 将80%乙醇固定的三代虫（1个虫体作为1个样品）充分干燥去除乙醇，置入1.5mL的离心管中， 冲液Ⅱ（见附录A.5），摇匀，11000g离心10min，收集上清液。然后，加人2倍上清液体积的一20℃预 冷无水乙醇，4℃下5000g离心10min弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清液，空气干燥后溶于 40uμLTE缓冲液（见附录A.2），一20℃保存备用。 2 SC/T 7219.6—2015 7.2.2rDNA-ITS的 PCR 扩增 PCR反应体系（25μL）中，加入20μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，dNTPs2μL，MgCl2 2.5μL,Taq酶缓冲液2.5μL,0.5UTaq酶以及模板基因组DNA1μL，最后用无菌去离子水定容到 25μL，无热盖加的PCR仪应加矿物油25μL。PCR扩增时，应设置阴性对照和阳性对照。 在PCR扩增仪中，94℃预变性4min，再94℃30s-50℃30s72℃1min，共35个循环；最后 72℃延伸10min。 7.2.3PCR产物电泳与测序 取5μLPCR产物，加人1μL溴酚蓝指示剂溶液（见附录A.9），混勾，用1.0%琼脂糖（含 0.5μg/mLEB)于TAE缓冲溶液（见附录A.7)中电泳分离，同时设置DNA分子量标准作参照，紫外 参见附录C。序列相似性在99%以上者，判定虫体为小林三代虫。 8综合判定 8.1小林三代虫的判定 如果在显微镜下观察到鲤、鲫的鳍条或鳃丝或体表的三代虫符合7.1的形态结构和测量数据，或根 据7.2的方法对PCR扩增产物测序，与附录C给出的序列进行比对分析，序列相似性在99%以上者， 均可判定虫体为小林三代虫。 8.2小林三代虫病的判定 鲫（包括金鱼）感染小林三代虫，数量多于其他三代虫种类的，且病鱼临床症状符合5.2描述，则判 定为小林三代虫病。 行业标准信息服务平台 SC/T7219.6—2015 附录A (规范性附录) 试剂及其配制 本附录所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。 A.1APG溶液 将饱和的苦味酸铵溶液和甘油按照1：1的比例混合。 A.2TE缓冲液 1mLTris-HCl(1mol/L，pH8.0)和0.2mLEDTA(0.5mol/L，pH8.0)混合，加无菌去离子水 定容至100mL，高压灭菌后4℃保存。 A.310%SDS溶液 10gSDS溶于90mL蒸馏水中，68℃助溶，用盐酸调pH至7.2最后加蒸馏水定容至100mL，室温 保存。 A.4DNA抽提缓冲液I 400μLTE缓冲液、16μL蛋白酶K（5mg/mL）和20μL10%SDS的混合溶液。 A.5DNA抽提缓冲液I 按Tris-HCI溶液饱和过的重蒸酚、氯仿、异戊醇以25：24：1的比例混合，密闭避光4℃保存。 A.6Taq酶缓冲液(10倍PCRbuffer) 0.5mol/LpH8.8的Tris-HCl、0.5mol/L的氯化钾(KCI)和1%的TritonX-100的混合溶液。 A.7TAE电泳缓冲液（50倍） 242.0gTris碱、37.2gNazEDTA·2HO混合，然后加人800mL的去离子水充分搅拌溶解，再加 入57.1mL的冰乙酸，充分混勾，加去离子水定容至1L，室温保存。 A.8核酸染色剂（ethidiumbromide,EB） 用水配制成10.0mg/mL的浓缩液。使用时，每10.0mL电泳液或琼脂中加1.0μL的EB。 A.9溴酚蓝指示剂溶液 溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶容解后移人溴 酚蓝溶液中。摇匀后，加双蒸水定容至50mL，加人氢氧化钠（NaOH)溶液1滴，调至蓝色， 4 SC/T7219.6—2015 附录B （规范性附录） 小林三代虫后吸器的形态测量 B.1小林三代虫后吸器锚钩的测量部位及大小见图B.1。 10 μm 说明： 全长(55.2 μm~65.7 μm); -钩尖长（25.2μm~29.9μm）； b 钩柄长（40.3μm~48.2μm）； d 基部长（15.9μm~22.5μm）。 图 B. 1 锚钩的测量部位及大小 B.2小林三代虫后吸器边