ICS 65.020.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T7220—2015 中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法 PCR detection method of Spiroplasma eriocheiris 行业标准信息服务平台 2015-02-09发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T 7220—2015 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由农业部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：南京师范大学。 本标准主要起草人：王文、孟庆国、顾伟、吴霆、李文杰、任乾、丁正峰。 行业标准信息服务平台 SC/T7220—2015 引 言 检测与《螺原体病原微生物的PCR快速检测技术》（专利号：ZL200510041005X)等相关的专利的使 用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人：南京师范大学 地址：江苏省南京市文苑路1号南京师范大学生命科学学院 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 行业标准信息服务平台 ⅡI SC/T72202015 中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法 1范围 本标准规定了对中华绒螯蟹螺原体病原分离、纯化以及PCR检测的方法。 本标准适用于中华绒螯蟹等水生甲壳动物（包括中华绒螯蟹Eriocheirsinensis、凡纳滨对虾 是以中华绒螯蟹为对象中华绒螯蟹螺原体感染的流行病学调查、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T7202.2—2007斑节对虾杆状病毒(MBV)病诊断规程第2部分：PCR检测方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 中华绒螯蟹螺原体spiroplasmaeriocheiris 具有体积小（可以滤过0.22um孔径滤膜）、会运动、有螺旋结构、没有细胞壁、可以用人工培养基培 养等特征。该病原侵染中华绒螯蟹血淋巴细胞后在其内大量繁殖形成包涵体，该病原还广泛侵染中华 绒螯蟹机体内所有器官（包括鳃、心脏、肝胰腺、肌肉、神经、消化道等）的结缔组织。螺原体侵染神经时， 可以引起宿主附肢颤抖，最终导致被感染宿主死亡。 4试剂和材料 4.1Chelex-100悬浊液（5%）：称取5.0gChelex-100混于100mL去离子水中，常温保存。 标准信息服 4.2酒精：100%，分析纯。 4.3蛋白酶K:20mg/mL。 4.4DL2000DNA分子量标准。 4.5溴化乙锭（EB)：10mg/mL。 4.6琼脂糖：电泳级。 4.7 dNTP:10mmol/L含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L的混合物，一20℃保存。 4.8TagDNA聚合酶:5U/μL，一20℃保存。 4.910×PCR缓冲液：-20℃保存。 4.105XTBE电泳缓冲液。 4.116X上样缓冲液。 4.12引物 F1:5'-GATCAATCAATTGGTTTA-3',R1:5'-GGTTAGTTCTCTCAGATAGTA- AGAA-3'用无菌去离子水配制成10umol/L，一20℃保存，用以扩增中华绒鳌蟹螺原体16srRNA- 23srRNA间区序列。 4.130.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS。 1 SC/T 7220—2015 4.14R2液体培养基：2.5gHIB，8g蔗糖，加双蒸水至84mL，121℃高压灭菌20min；15mL胎牛血清 （56℃灭活0.5h），1mL酚红，100mg青霉素，0.22um滤器过滤灭菌；高压灭菌部分冷却至50℃以下与 过滤灭菌部分混匀即得100mLR2液体培养基。 4.15阳性对照为已知感染中华绒螯蟹螺原体且中华绒螯蟹螺原体分离培养和PCR结果显示阳性的 中华绒螯蟹肌肉组织提取的DNA，一20℃保存。 4.16阴性对照为已知未感染中华绒螯蟹螺原体且中华绒螯蟹螺原体分离培养和PCR结果显示阴性 的中华绒鳌蟹肌肉组织提取的DNA，一20℃保存。 5仪器设备 5.1医用镊子、医用解剖刀、医用剪刀。 5.21mL次性注射器。 5.3台式高速离心机：最高转速可达12000r/min以上。 5.4恒温培养箱：能满足30℃要求。 5.5普通冰箱：具有冷藏箱，一18℃以下冷冻箱体。 5.6微量移液器：量程0.1μL~2.5μL、1μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。 5.7微量离心管：1.5mL。 5.8PCR仪。 5.9电泳仪和水平电泳槽：输出直流电压0V~600V。 5.10凝胶成像仪。 5.11水浴锅或者金属浴。 5.12微波炉。 5.13PCR管:0.2mL。 5. 14 滤器：0.22μm。 5.15涡旋振荡器。 6采样 采样数量、运输以及保存按SC/T7103的规定执行。中华绒螯蟹体表用70%酒精消毒，用1mL 一次性注射器抽取第三步足基部的血淋巴液，与两倍体积的PBS缓冲液混匀后用0.22um孔径滤器过 滤，滤液用于中华绒鳌蟹螺原体的分离培养；而后用无菌剪刀剪取中华绒螯蟹一条步足，去掉外壳后，取 肌肉约0.1g用于DNA提取。中华绒螯蟹以外的水生甲壳动物取样方法类似。 7检测方法 7.1中华绒螯蟹螺原体分离、培养 7.1.1待测个体体表70%酒精消毒，1mL一次性注射器抽取血淋巴液与灭菌处理后的PBS缓冲液 1：2体积比混匀。 7.1.2将上述混匀的血淋巴液通过0.22μm孔径滤器，收集滤过液。 7.1.3将上述滤液50L无菌接种至1mLR2液体培养基，30℃恒温培养20d。 7.1.4逐日观察培养基颜色变化，培养基颜色由红变黄且澄清透明，可初步判断为中华绒螯蟹螺原体 阳性；若恒温培养15d以上培养基仍无颜色变化，可判断待测样品为中华绒螯蟹螺原体阴性。 7.1.5分离培养物PCR检测：见7.2。 2 SC/T7220—2015 7.2PCR检测 7.2.1DNA模板的提取 7.2.1.1取所检测动物肌肉组织一小块（约0.1g)切碎，转移到灭菌的1.5mL微量离心管中(分离培 养物PCR检测时，取分离培养物1mL，10000r/min离心10min取样）。 7.2.1.2用200μL5%的chelex-100悬浊液重悬，加人5μL（20mg/mL)的蛋白酶K溶液，涡旋振荡 器混合均匀后56℃水浴锅孵育，期间不断颠倒混匀。如1.5h后仍见溶液浑浊，可再补加相同浓度蛋白 酶K溶液2μL混合均勾后继续孵育，2h时观察溶液的浑浊程度。如果澄清，则取出进行下一步的实 验；若仍然显示浑浊状态，延长孵育时间到2.5h。 7.2.1.3颠倒混匀，转移至98℃水浴锅内孵育8min。 7.2.1.4颠倒混匀，4℃,12000r/min离心30min。 7.2.1.5离心后的上清液转移到一新的1.5mL灭菌Eppendorf管中，此上清液即需要进行PCR鉴定 的DNA的溶液。 7.2.2PCR反应体系的准备 7.2.2.1PCR反应体系的准备必须在洁净的区域完成。 7.2.2.2PCR反应体系中使用引物F1和R1,模板为提取的样品DNA,其反应预混物见表1。 表1100份PCR反应预混物所需试剂组成 试剂 25μL体系 50μL体系 100μL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液（无Mg+） 250μL 500μL 1000μL 1x MgCl, (25 mmol/ L) 150 μL 300 μL 600 μL 1. 5 mmol/ L dNTP(10 mmol/ L) 50 μL 100 μL 200 μL 0. 2 mmol/ L 10μmol/L引物F1 250 μL 500 μL 1000μL 1 μmol/ L 10μmol/L引物R1 250 μL 500μL 1 000 μL 1 μmol/ L 灭菌双蒸水 1 300 μL 2600μL 5 200 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 50 μL 100 μL 200,L 0. 1 U/ μL 注：25uL体系模板量2pL/反应管；50μL体系模板量4μL/反应管；100μL体系模板量8μL/反应管。 7.2.2.3检测前，在洁净区按比例分别加人PCR试剂，同时带人样品区待用。 7.2. 3PCR操作 7.2.3.1对每份样品用单独的枪头定量吸取待测模板，待测模板除抽提的样品DNA外同时设阳性对 照、阴性对照和以无菌双蒸水为模板的空白对照。分别将各模板溶液加到各支PCR反应预混物中，盖 严管盖（样品区完成） 7.2.3.2将PCR管带人扩增区,PCR管在手掌型离心机上离心1s～2s，放人PCR仪中，盖上PCR 仪。首先进行预热反应90℃2min，再按以下程序进行扩增反应：94℃1min，52℃1min，72℃ 1.5min，35个循环，72℃延伸10min。4℃保温（扩增区完成）。 7.2.4PCR产物的分析 按照SC/T7202.2—2007中7.1.5~7.1.8的规定执行。 7.2.5PCR产物序列测定 PCR产物可以用引物F1和R1进行序列测定，以判断该序列的