ICS 65.020.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7218.42015 指环虫病诊断规程 第4部分：坏鳃指环虫病 Protocols for diagnosis of Dactylogyriasis- Part 4:Infection with Dactylogyrus vastator 行业标准信息服务平台 2015-02-09发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T7218.4—2015 前言 SC/T7218《指环虫病诊断规程》为系列标准： 第1部分：小鞘指环虫病； 一第2部分：页形指环虫病； 一第3部分：鳙指环虫病； 一第4部分：坏鳃指环虫病； 本部分是《指环虫病诊断规程》的第4部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部渔业渔政管理局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。 本部分主要起草人：曹杰英、张志华、刘文青、李全振、李凤超、康现江、赵宝华、申红旗、侯金良。 行业标准信息服务平台 I SC/T 7218.4—2015 指环虫病诊断规程 第4部分：坏鳃指环虫病 1范围 本部分规定了坏鳃指环虫病的流行情况与临床症状，以及坏鳃指环虫（Dactylogyrusastator）采 集与固定、形态学鉴定和分子检测的方法。 本部分适用于鲤、鲫、金鱼等淡水鱼类患坏鳃指环虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3试剂和材料 3.1水：配置试剂用水应符合GB/T6682中一级的规定。 3.2乙醇：分析纯。 3.3Tag酶：一20℃保存，不得反复冻融或温度剧烈变化。 3.4dNTPs：含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物。 3.5上游引物F:5'-TTATGTGGACCTCTGT-3”。 3.6下游引物R:5'-AGCCGAGTGATCCACCA-3'。 3.7 DNAMarker:2000bp、1000bp750bp、500bp.250bp、100bp。 业标准信息服务平台 3.8其他试剂见附录A。 4仪器和设备 4.1体视显微镜和生物显微镜。 4.2台微尺、目微尺、显微摄影设备。 4.3PCR扩增仪。 4.4紫外透射仪或凝胶成像仪。 4.5电泳仪。 4.6普通冰箱和超低温冰箱。 4.7离心机和离心管。 4.8电子天平。 4.9恒温水浴箱和微波炉。 4.10微量移液器及吸头。 4.11解剖盘、剪刀、镊子、解剖针。 4.12载玻片、盖玻片、橡皮泥、培养皿和吸管。 1 SC/T 7218. 4—2015 5流行情况与临床症状 5.1流行情况 坏鳃指环虫能感染鲤（Cyprinuscarpio）、鲫（Carassiusauratus）、金鱼（Carassiusauratus）等。全 国各地均可发生，发病高峰水温为20℃~25℃。 5.2临床症状 坏鳃指环虫主要寄生于鱼的鳃部。病鱼鳃组织损伤，鳃丝肿胀、贫血，有斑点状淤血，鳃上有大量黏 液。重度感染时，鳃丝显著肿胀，鳃盖张开，病鱼极度不安、窜动、狂游，或游动缓慢、呼吸困难、上浮水面 而死。 6指环虫采集与固定 6.1病鱼采集 捞取具有典型症状的鱼。如果现场无病原分离条件，将采集的病鱼用80%乙醇固定。样品封存和 运输应符合SC/T7103的规定。 6.2指环虫样品的采集 用针刺鱼脑，将鱼杀死。完整的取下全鳃，用小剪刀将鳃片分离，取一片鳃置于培养皿中，洒水少 许。用解剖针将虫体从鳃丝上剥离，用吸管吸出，放在载玻片上。在盖玻片的四角涂少量橡皮泥避免盖 玻片将虫体直接压碎，用镊子轻压盖玻片，显微镜下观察。 6.3指环虫样品的固定与保存 加一滴清水到载玻片上，用吸管吸取一个虫体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片，用一张滤纸在盖玻 片边缘缓慢吸水，直到水基本吸干为止。加上一滴APG溶液（见A.1）到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片 与载玻片之间的空隙。用于形态学鉴定的虫体样品用70%乙醇保存，用于分子检测的虫体样品用95% 乙醇保存。 7坏鳃指环虫的鉴定 7.1坏鳃指环虫样品的形态学鉴定 显微镜下指环虫前端有2对头器、2对黑色眼点，呈方形排列，此为判断指环虫的简易特征。微调 焦距即可观察到指环虫后吸器的中央大钩、联结片和边缘小钩，指环虫靠近头部端可观察到交接器，后 吸器与交接器是指环虫鉴定的重要特征。根据需要用镊子轻压盖玻片以凸显几丁质结构进行拍照。 坏鳃指环虫虫体中型，体长0.41mm~0.86mm，宽0.11mm~0.18mm。中央大钩的内突外突均 极发达，后吸器只有一联结片，联结片呈直线型。边缘小钩可明显区分出柄、柄轴及钩尖基突三部分。 支持器基部与管基部相连，于中部分出一叉，钩抱于交接管，另一叉则向前略超过管端部。400倍显微 镜下对坏鳃指环虫进行形态学鉴定，其中央大钩、联结片交接器的形态特征参见图B.1、图B.2、图 B.3。坏鳃指环虫的形态学测量特征指标见表1。 表1坏鳃指环虫形态学指标 单位为微米 测量的特征 变动范围 中央大钩全长 32.2~35.5 中央大钩基部长 27.2~29.0 中央大钩外突长 12.0~13.0 中央大钩内突长 16.0~19.0 中央大钩钩尖长 22.0~26.0 边缘小钩全长 19.4~38.6 2 SC/T7218.4—2015 表1(续) 测量的特征 变动范围 联结片长 5.0~6.0 联结片宽 35.0~44.0 交接管长 43.5~45.5 支持器长 24.0~29.0 7.2坏鳃指环虫的分子检测 7. 2. 1 虫体 DNA 的提取 用吸管吸取乙醇固定的虫体标本1个，充分干燥以除去多余的乙醇后，转移至0.2mL离心管中。 用100μLTE缓冲液（见A.2)浸洗2h3h，离心后弃上清，加人9μL裂解液（见A.3），未经乙醇固定 保存的虫体则直接加裂解液。65℃水浴30min后，95℃处理10min，该裂解产物不需要进一步纯化就 可直接作为PCR的模板。也可用同等效用的试剂盒提取虫体DNA。 7.2. 2 PCR 扩增 反应在50μL体系中进行：10倍浓缩缓冲液（见A.4）5μL，dNTPs2μL，引物（10μmol/L）各2μL， DNA模板2μL，Taq酶1μL，双蒸水36μL。反应程序为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃1min， 共25个循环；最后72℃10min。PCR反应应设置阴性对照和阳性对照。 7.2.3PCR产物的电泳和测序 用1XTAE电泳缓冲液（见A.5）配成1%琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解，待冷却 至60℃左右加人核酸染料GoldView（见A.6）至终浓度为3μL/100mL～4μL/100mL，混匀后倒人封 固好的制胶板中，凝胶厚度在3mm～5mm，插入宽度适当的梳子。待凝胶完全凝固后，小心拔出梳子， 拆去封条，将凝胶放人装有1XTAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液刚好没过胶面（约1mm）。 以5V/cm的电压电泳。当溴酚蓝电泳至适当位置后，用紫外观察灯或凝胶成像仪观察并记录结果。 PCR阳性产物会出现一条与坏鳃指环虫（989bp)ITS1基因扩增片段一致的目的条带，空白对照没有该 目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序。 8综合判定 8.1在显微镜下观察鲤、鲫、金鱼等鱼类的鳃丝，如果观察到虫体，且符合7.1描述的坏鳃指环虫特征， 则判断为坏鳃指环虫。如果形态鉴定不能完全确定指环虫种类，可进一步用PCR方法扩增其ITS1序 列，经测序后与坏鳃指环虫的参考序列（参见附录C)进行对比，序列相似性在99%以上者，则判断为坏 鳃指环虫。 8.2鲤、鲫、金鱼等鱼类感染坏鳃指环虫，且病鱼临床症状符合5.2的描述，则判定为坏鳃指环虫病。 3 SC/T 7218.4—2015 附录A （规范性附录） 试剂及其配制 A.1APG溶液 将饱和的苦味酸铵溶液和甘油按照1：1的比例混合即成。 A.2TE缓冲液 pH 9.0 Tris - HCl 500mmol/l EDTA 200mmol/L NaCl 10 mmol/ L A.3裂解液 0.45%NP-40.0.45%Tween-20、100mmol/LEDTA和100μg/mL蛋白酶K。蛋白酶K用 50mmol/LTris-HCl (pH8.0)和1.5mmol/LCaAc2配置。 A.410倍浓缩缓冲液（10×buffer）pH8.8 Tris - HCl 100mmol/L 氯化钾(KCI) 500 mmol/ L 氯化镁（MgClz） 15mmol/L A.55倍TAE电泳缓冲液(5×TAEbuffer) Tris 54. 0 g 硼酸 27.5 g 2.9 g EDTA 加双蒸水溶解到1000.0mL,用5.0mol/L的盐酸(HCI)调pH到8.0。 A.6核酸染料(Goldview) 用水配成10.0mg/mL的浓缩缓冲液。用时每20.0mL电泳液或琼脂中加1.5μL。 A.76倍上样缓冲液（6×buffer） 溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g加双蒸水溶解后移人溴 酚蓝溶液中，摇匀后定容至5